2021.09.10 何波分享“肠道内的硫酸化修饰抑制结肠炎和结肠癌的进程”的故事

本文通讯作者是来自于美国匹兹堡大学谢文教授，他长期从事核受体介导的基因表达调控与代谢、生理和病理机制研究。

背景：结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发生率仅次于胃癌和食道癌。目前，早发现、早诊断、早治疗仍是保证结直肠癌患者良好预后的关键。CRC的病因和进展涉及遗传和环境因素。遗传因素包括家族性腺瘤性息肉病、林奇综合症及基因突变，如APC、PMS2、MUTYH、KRAS和TP53等基因。同时与炎症性肠病(IBDs)相关的肠道炎症（包括克罗恩病及溃疡性结肠炎）都是结直肠癌发生发展的重要危险因素。尽管目前CRC的发病机制及治疗方面都已取得了一定的进展，但患者的总体生存及预后仍不容乐观。因此，继续深入研究CRC的发病机制及寻找潜在的药物治疗靶点，具有十分重要的临床意义。

近年来，硫酸化修饰逐渐受到科学家关注。多项研究发现硫酸化修饰与人类疾病（重点包括肿瘤）的发生发展密切相关。所谓的硫酸化是指无机硫酸盐在酶的催化下形成具有生物活性的有机硫酸化物的生化过程，而无机硫酸盐形式的元素硫只有经过代谢活化后才能被生物体利用。硫酸化的大致过程如上图，由上述多种酶及相关转运体精密调节，进而参与多种生物学功能。目前，在生物学领域，硫酸化修饰的重要性是公认的，但是由于限制于技术的发展，大部分硫酸化的生物学功能还是未知的。如在包括IBD在内的胃肠道疾病患者中观察到肠道内硫酸化水平降低，但其机制尚不清楚。同时，PAPSS2或硫酸化修饰是否以及如何在结肠炎和结肠癌中发挥作用尚未见报道。基于此，作者关注到PAPSS2，探究PAPSS2作为PAPS合成的关键酶是否以及如何在结肠炎和结肠癌变中发挥作用。

研究发现：作者对结肠癌标本的组织阵列、基因表达数据和肿瘤患者的临床特征进行分析，以及构建PAPSS2基因的特异性肠道缺失小鼠模型，并在此小鼠模型上构建AOM/DSS小鼠结肠癌模型。作者发现PAPSS2基因的特异性肠道缺失可使小鼠对结肠炎和结肠癌更加敏感，进一步发现PAPSS2的缺失导致硫粘蛋白形成减少和胆酸稳态破坏，从而破坏肠道粘膜屏障功能。总的来说，PAPSS2介导的硫酸化在结肠炎和结肠癌发生中的扮演着重要作用。

图1：首先作者通过对TCGA数据库进行分析，发现PAPSS2的表达水平在23种癌症中有14种降低，其中包括结肠癌(图1A)。随后，与健康对照组相比，在早期CRC患者的正常结肠黏膜中也观察到PAPSS2表达降低(图1B)。通过对结肠癌组织 (包括71例CRC肿瘤)的免疫组化分析，同样证实了PAPSS2在人结肠癌组织中的表达降低(图1C)。接下来，在AOM/DSS诱导的小鼠结肠癌中，PAPSS2的 mRNA水平(图1D)和蛋白水平(图1E)表达均降低，与患者结果一致。以上这些结果提示，PAPSS2可能在结肠癌发生中发挥作用。

图2：作者为了研究PAPSS2的肠道功能，构建了肠道特异性PAPSS2敲除小鼠模型，并通过多种实验验证了PAPSS2 肠道特异性敲除小鼠的小肠、结肠和结肠上皮细胞的PAPSS2基因被特异性敲除，而包括肝在内的其他组织器官并没有明显变化。同时在PAPSS2敲除小鼠模型中发现PAPS含量显著降低(图2B)。酪氨酸硫酸化是蛋白质硫酸化的标志，作者通过使用抗硫酸化酪氨酸的抗体进行免疫荧光(图2C)和WB(图2B)实验，发现PAPSS2敲除的小鼠结肠上皮中的总酪氨酸硫酸化水平显著降低。与炎症性肠病IBD相关的结肠炎，包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）,是结肠癌发生发展的一个重要风险因素。IBD是累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病，其临床表现腹泻、腹痛，甚至可有血便。作者对GEO数据集进行生信分析显示，与非IBD结肠活检相比，在活动性炎症性UC和CD患者的结肠活检中，PAPSS2 mRNA表达显著下调，紧密连接蛋白OCLN和ZO-1下调，同时炎性相关基因表达水平增加。作者想进一步确定PAPSS2特异性肠道缺失是否会使小鼠对结肠炎敏感，随后在雄性PAPSS2 敲除小鼠模型的基础上，构建结肠炎小鼠模型，即在老鼠的饮用水中加入3% DSS 处理6天后进行结肠组织采集。

作者发现DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠发生的结肠炎症状更重，包括体重明显减轻(图2E)、疾病活动指数增加(图2F)、结肠重量减少(图2G)和结肠长度减少(图2H)，以及组织学黏膜损伤增加(图2I)。进一步发现器官损伤具有结肠特异性的，表现为两种基因型之间的小肠长度和重量、脾脏重量和肝脏重量没有差异(补充图3A E)。在DSS处理的PAPSS2 敲除小鼠中，炎症和巨噬细胞相关基因的mRNA(图2J)和蛋白(图2K)表达水平增加，以及血清炎症细胞因子水平增加。以上数据都证明了肠道特异性敲除PAPSS2可使小鼠对结肠炎敏感。

图三：作者为了继续探寻PAPSS2及肠道硫酸化在结肠癌发生发展中的作用机制，在PAPSS2ΔIE小鼠模型基础上构建了AOM/ DSS模型。首先在经典的AOM/DSS模型中，发现PAPSS2ΔIE小鼠因对结肠癌敏感性显著升高而无法存活(数据未显示)。然后，作者将DSS降低到2%，并改为两个7天周期，持续时间共16周。在这个修订的方案中，PAPSS2ΔIE小鼠表现出更严重的结肠癌，表现为结肠组织的大体外观(图3A)、肿瘤总面积(图3B)、肿瘤数量(图3C)和大肿瘤数量(直径大于2 mm)。在组织学水平上，PAPSS2ΔIE小鼠的肿瘤组织显示BrdU标记染色增加(图3F)和Ki67染色增加(图3G)。且 PAPSS2ΔIE肿瘤小鼠的体重降低(图3H) ,死亡率(31.3%)是对照组(14.3%)的两倍多(图3I)。直肠脱垂通常是结肠癌的最初临床症状，作者发现PAPSS2ΔIE肿瘤小鼠出现直肠脱垂的时间更早，且发生率更高(图3J)。因AOM/ DSS模型是在炎症的基础上建立的小鼠肿瘤模型，作者进一步发现，在PAPSS2ΔIE肿瘤小鼠中，结肠癌变的加剧同时伴随着炎症的增加，结肠和/或回肠中炎症和巨噬细胞标志物的mRNA(图3K)和蛋白(图3L)表达增加，以及在血清中也发现炎性因子水平也增加(图3M)。随后，作者为了确定在没有结肠炎存在的情况下，PAPSS2肠道缺失是否使小鼠对结肠癌敏感。作者对PAPSS2ΔIE小鼠进行了标准的6轮AOM结肠癌变的诱导，同样也发现PAPSS2ΔIE小鼠结肠癌变更重，表现为肿瘤发生率增加(图3N)，肿瘤总面积增加(图3O)，结肠长度减少(图3P)。在组织学水平上， Ki67免疫染色显著增加(图3Q)。这些结果都证明了PAPSS2在结肠癌发生发展中的起着重要的作用。

图四：通过前面的结果，已确定PAPSS2在结肠炎与结肠癌中都处于低表达的水平，且PAPSS2的缺失有利于结肠炎与结肠癌的发生发展。目前PAPSS2的动物表型已经明确，作者想进一步确定其作用机制。众所周知，肠道粘膜屏障主要由机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障四部分组成，这些功能分别有相应的结构基础。肠道粘膜屏障是防止肠道内有害物质和病原体进人体内环境，并维持机体内环境稳定的一道重要屏障。其中化学屏障由肠粘膜上皮分泌的粘液、消化液及肠腔内正常寄生菌产生的抑菌物质构成。在化学粘膜屏障中，黏液蛋白是胃肠道黏液的主要大分子组分。其中硫粘蛋白作为黏液蛋白的重要组分，在维持肠道粘膜屏障的功能中起着至关重要的作用。作者对结肠切片分别用不同的染料染色来检测硫粘蛋白和中性粘蛋白。与相应的PAPSS2 fl/fl小鼠模型相比，在DSS未处理(图4A)和处理(图4B)的PAPSS2ΔIE小鼠中，硫粘蛋白的染色明显减弱。相反，中性粘蛋白水平在这两种基因型之间没有差异。由于肠内硫粘蛋白含量对肠屏障功能至关重要，为了确定PAPSS2是否会损害肠屏障，作者运用异硫氰酸荧光素和右旋糖酐对老鼠进行灌胃处理。发现DSS未处理和处理的PAPSS2ΔIE小鼠血清中异硫氰酸荧光素和右旋糖酐水平均升高，且在DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠结肠切片中观察到更多的荧光信号。这些结果提示PAPSS2ΔIE小鼠肠道通透性增加。同时发现，PAPSS2ΔIE小鼠肠道紧密连接相关蛋白OCLN和ZO-1的表达水平降低(图4 d，4 e)，血清内毒素水平增加(图4F),以及电镜显示小鼠紧密连接的结构完整性受损(图4G，左)、结肠微绒毛表面粗糙 (图4G，右)。在功能水平上，通过荧光原位杂交(图4H)和菌落形成单位试验(图4I)显示，经DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠上皮内的细菌浸润和细菌易位增加。且中性粒细胞和单核细胞浸润的标记物髓过氧化物酶的结肠免疫染色和活性增加(图4J)，巨噬细胞标记物Cd68的免疫染色也增加(图4K)。PAPSS2ΔIE小鼠结肠炎加重，伴随M1巨噬细胞(促炎亚型)相关基因mRNA表达增加(图4L)和免疫染色增加(图4M)，而 M2亚型(抗炎亚型)标相关基因没有出现显著变化。结果表明：肠内特异性敲除PAPSS2可破坏黏液蛋白硫酸化水平，进而影响肠内硫粘蛋白含量，破坏肠道屏障，最终促进结肠炎的发生发展。

图5：作者接下来探讨PAPSS2在结肠癌中的发生机制。同图四结果一致，在AOM/ DSS诱导的PAPSS2ΔIE小鼠肿瘤模型中采集结肠组织，也观察到硫粘蛋白含量的降低，而在瘤内却几乎检测不到(图5A)。在正常情况下，结肠黏液层形成一个屏障，阻止细菌进入上皮细胞。如图5B所示，未处理和AOM/ DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠黏液层厚度均降低。与结肠炎模型的结果一致，经AOM/ DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠的血清中异硫氰酸荧光素和右旋糖酐的水平较高(图5C)，紧密连接蛋白表达降低(图5D和E)，血清中内毒素水平升高(图5F)，导致肠道渗漏。AOM/ DSS处理的PAPSS2 DIE小鼠上皮细胞的细菌浸润和细菌易位增加(图5G，图5H)，CD68阳性巨噬细胞的浸润(图5I)和巨噬细胞M1亚型标记物的表达(图5J和K)也升高，表明肿瘤微环境恶化。

图6：目前已有研究发现胆汁酸在结肠癌发病机制中起着重要作用。其中硫酸化胆汁酸的毒性远小于非硫酸化胆汁酸，硫酸化胆汁酸更溶于水，更容易通过尿液和粪便排出体外，因此硫酸化是胆汁酸解毒和消除的重要代谢途径。作者发现经AOM/ DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠血清(图6A)和结肠组织中胆汁酸水平升高。FXR是一种胆汁酸受体，它的活化已被证明具有抗结肠癌活性。作者检测发现，在AOM/ DSS处理的PAPSS2ΔIE小鼠中，FXR通路的多个靶基因如Fgf15的 mRNA水平均显著降低(图6C),这说明PAPSS2的敲除可抑制FXR信号通路。作者随后对胆红酸种类进行分析，发现其中具有FXR拮抗作用的胆红酸都显著升高，这在一定程度上解释了FXR通路受抑制的原因。同时，作者也发现了在结肠组织中硫酸化胆汁酸的量是减少的(图6),而本底胆汁酸的水平是升高的，特别是在AOM/DSS处理后(图6G)。以上结果表明，在PAPSS2ΔIE小鼠模型中，结肠癌发生的增加伴随着胆汁酸稳态的破坏和FXR通路的抑制。

图七：随后作者为了解PAPSS2表达与结肠癌患者临床预后的相关性，通过生信分析发现PAPSS2的低表达与结肠癌患者低生存率密切相关。且PAPSS2的表达与紧密连接相关蛋白OCLN的表达呈现出显著的正相关性，与IL-1b、IL-6、TNFa的表达呈负相关。这些结果表明，PAPSS2的下调与炎症、肠道屏障受损和结肠癌变密切相关。PAPSS2可通过调控粘蛋白和胆红酸的硫酸化水平，进而改善粘膜屏障功能和降低炎症反应来抑制结肠癌的发生发展。

在这项研究中，作者发现PAPSS2的低表达与人类结肠炎和结肠癌发病率的增加密切相关。小鼠肠道特异性敲除PAPSS2可促进DSS诱导的结肠炎和AOM诱导的结肠癌变。PAPSS2可通过PAPSS2 - PAPS硫酸化轴促进肠道内硫粘蛋白的保护作用及维持胆汁酸稳态，最终抑制结肠炎及相关结肠癌发生发展进程。综上所述，作者发现PAPSS2 - PAPS硫化轴在结肠炎和结肠癌的发生发展中起者重要作用，并为IBD和结肠癌提供了潜在的诊断标记物及治疗靶点。