ELISA

一、包被抗原

     1.用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为 10-20 µg/ml，

　加100 µl/孔到 96 孔酶标板，4 ^oC  放置过夜。

     2.第二天弃去包被液后，用 PBST洗涤 3次，每孔加入 150µl 1％BSA 37^oC　封闭1小时。

    3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 µl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品， 37 ^oC 孵育 2 小时。

     4.  PBST 洗涤 5 次后，加入 100µl 稀释后的HRP 标记的二抗，37 ^oC  孵育 1 小时。

     5.  PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A₄₀₅吸收值。

二、包被细胞

1.      在 96孔培养板上接种细胞数为 1 x 10⁴cells/well，37℃过夜培养。

2.     第二天用 PBS洗涤培养板 2-3次。

3.      加入 125µl/well 10% Formalin（1:10稀释）,室温下固定 15 min。

4.      用 ddH₂O洗涤培养板 3次，并晾干，储藏在 2-8^oC备用。

5.      用 PBST洗涤 3次，每孔加入 150µl 1％ BSA  37^oC 封闭 1小时。

6.      PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 µl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品， 37 ^oC 孵育 2 小时。

7.      PBST 洗涤 5 次后，加入 100 µl 稀释后的 HRP 标记的二抗,37 ^oC 孵育 1 小时。

8.      PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A₄₀₅吸收值。

 50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4℃，保存,Na₂CO₃  0.15 克, NaHCO₃ 0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。

 ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：

        0.2M Na2HPO4 2.4ml

         0.1M 柠檬酸 2.6ml

         ddH2O 5ml

         ABTS 5mg

         H2O2(30%) 4 ul（用前加入）

注 意：

一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。不同的显色系统对应不同的光吸收值。