免疫组化实验步骤

免疫组化的准备工作

一．  免疫组化用的液体的配置

1．  PBS的配置（PH7.2~7.6）

蒸馏水 4000ml

氯化钠 Nacl 36g

磷酸氢二钠 Na2HPO4.12H2O 24g

磷酸二氢钠 NaH2PO4.2H2O 1.6g

2．0.01柠檬酸盐缓冲液的配置

蒸馏水 1000ml

枸橼酸三钠C6H5Na3O7. 2H2O 3g

枸橼酸  C6H8O7.H2O 0.4g

3．苏木素

免疫组化实验方法

实验步骤

石腊切片：40℃过夜，60℃烤片1小时

1．  常规脱蜡至水：二甲苯（1）、（2）各10min，100%酒精（1）、（2）各5min，95%、85%、蒸馏水（1）、（2）各5min；

2． 抗原修复：枸橼酸缓冲液(Ph6.0) 微波炉高火加热至沸，取出，放入玻片，低火维持30min；

3．  室温放置自然冷却，PBS冲洗5min*3次；

4．  3%过氧化氢in甲醇溶液，避光室温10min，去除内源性过氧化物酶；

5．  PBS冲洗5min*3次；

6.   封闭：10%正常二抗血清37℃15min，甩干不洗；

7．  滴加稀释一抗（可先用1：100浓度），然后4℃过夜。用PBS替代一抗作为阴性对照，约12-16小时；

8．  次日取出，室温放置10min，PBS洗5min*3次；

9．  滴加二抗，37℃30min；

10．  PBS洗5min*3次；

11.  滴加HRP标记的链霉亲和素，37℃15min；

12.  PBS洗5min*3次；

13.  DAB显色：DAB按试剂说明书配置，镜下观察，至目的组织出现棕黄色阳性颗粒而周围组织无非特意显色时，蒸馏水终止；

14．苏木素复染细胞核1-2分钟，1%盐酸乙醇分化数秒，镜下控制，自来水返蓝10min;

15．脱水、透明： 85% 、95%、100%酒精（1）、（2）各2min,二甲苯（1）、（2）各5min,中性树胶封片。

石腊切片：40℃过夜，60℃烤片1小时

1．常规脱蜡至水：二甲苯（1）、（2）各10min，100%酒精（1）、（2）各5min，95%、85%、蒸馏水（1）、（2）各5min；

2． 抗原修复：枸橼酸缓冲液(Ph6.0) 微波炉高火加热至沸，取出，放入玻片，低火维持30min；室温放置自然冷却，PBS冲洗5min*3次；

3．3%过氧化氢in甲醇溶液，避光室温10min，去除内源性过氧化物酶；PBS冲洗5min*3次；

4．封闭：10%正常二抗血清37℃15min，甩干不洗；

5．滴加稀释一抗（可先用1：100浓度），然后4℃过夜。用PBS替代一抗作为阴性对照，约12-16小时；次日取出，室温放置10min，PBS洗5min*3次；

6. 滴加二抗，37℃30min；PBS洗5min*3次；

7．滴加HRP标记的链霉亲和素，37℃15min；PBS洗5min*3次；

8．DAB显色：DAB按试剂说明书配置，镜下观察，至目的组织出现棕黄色阳性颗粒而周围组织无非特意显色时，蒸馏水终止；

9．苏木素复染细胞核1-2分钟，1%盐酸乙醇分化数秒，镜下控制，自来水返蓝10min；

10．脱水、透明： 85% 、95%、100%酒精（1）、（2）各2min,二甲苯（1）、（2）各5min,中性树胶封片。

实验步骤

石腊切片： 60℃烤片3小时

1. 常规脱蜡至水：二甲苯（1）30分钟、二甲苯（2）各10min，100%酒精（1）、（2）各5min，95%、85%、蒸馏水（1）、（2）各5min；

2. 抗原修复：枸橼酸缓冲液(Ph6.0) 微波炉高火加热至沸，取出，放入玻片，低火维持30min；   室温放置自然冷却，PBS冲洗5min*3次；

3. 滴加正常山羊封闭血清工作液：在湿盒中37℃封闭30分钟，甩干不洗；

4. 滴加一抗：湿盒中4℃孵育过夜，再用PBS冲洗，5分钟×3次；

5. 滴加荧光二抗：室温置湿盒中避光孵育2小时，用PBS 冲洗，5分钟×3次；

6. 滴加DAPI：避光孵育2分钟，用PBS 冲洗，2分钟×3次；

7. 用抗荧光衰减封片剂封片。