黄灿华教授 实验室

2022.12.03 左静分享“Lin28B通过miRNA let-7s调控细胞自我更新”的故事

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大家好,今天给大家分享一篇2022年2月发表在nature communications上题为《Lin28B-high breastcancer cells promote immune suppression in the lung pre-metastatic niche via

exosomes and support cancer progression》的研究性文章。

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文章的通讯作者是来自中科院营养代谢与食品安全重点实验室的詹丽杏教授,她主要从事于肿瘤代谢及细胞极性的分子调控机制,近些年来出版了不少相关方面的研究性论文。

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首先介绍一下与本文内容密切相关的背景知识。这篇文章的主人公是Lin28B,它是一种高度保守的RNA结合蛋白,在成熟组织中极低表达,而在胚胎干细胞中高表达,是干细胞自我更新的调控因子;同时,它在多种肿瘤中也异常上调,与肿瘤不良预后密切相关。Lin28B能通过增加肿瘤干性和转移能力促进乳腺癌进展(本文聚焦于转移起始-转移前免疫抑制性微环境的形成),miRNA let-7s是Lin28B的主要调控靶点,是Lin28B调控细胞自我更新的重要机制。

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根据功能的不同,中性粒细胞可以分成两类,即N1/N2型,其中N1型促炎促肿瘤,N2型促炎抗肿瘤(ROS/RNS,NETs,协同免疫激活/抑制);N1与N2型可在特定微环境中发生极化(Type I IFN/TGF-β)。

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外泌体(exosome)是细胞释放到细胞外空间的膜结合颗粒,能携带大量功能性内容物,如蛋白质,脂质、核酸、代谢物等,因此可作为一类生物标志物,治疗剂或治疗载体。

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本文用到了三种小鼠模型,分别是:1. Orthotopic breast cancermodel: 原位乳腺癌模型;2. MMTV-PyMT: 乳腺特异性过表达癌基因PyMT,第8周开始发病,第14周达到晚期乳腺癌水平;3. MMTV-Neu: HER2+乳腺癌模型,乳腺特异表达ErbB2,4月龄开始发生乳腺癌,75%的荷瘤小鼠可存活到8月龄甚至更久,肿瘤可以转移到肺部。

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文章中涉及到的免疫细胞相关的marker主要包括如图所示的这些内容。

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这是总结出来的逻辑流程图,接下来就以这张图为基础,分点给大家汇报分享这篇文章。


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作者发现,Lin28B在乳腺肿瘤组织以及转移组织中表达升高,且其随着恶性程度与临床分期的增加而增加,因此Lin28B可能与乳腺癌进展密切相关。


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并且,Lin28B表达量越高,乳腺癌模型小鼠及病人的生存期越短,Lin28B与乳腺癌转移及不良预后紧密相关。

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接下来,作者利用干预Lin28B表达的乳腺癌原位小鼠及MMTV-PyMT与MMTV-Neu模型,结果显示,Lin28B对乳腺癌的原位生长没有影响,但能显著促进其肺转移。


紧接着,作者从免疫微环境的角度出发探索其机制,发现Lin28B-high的乳腺癌细胞在前3周未发生肺转移,但转移相关特异性基因的表达显著上调,因而前3周形成了特定的转移前肿瘤微环境。作者发现尽管白细胞总数未发生变化,但接种Lin28B-high 的乳腺癌细胞小鼠肺部中性粒细胞的绝对数以及百分比显著增加。


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小鼠接种Lin28B-high乳腺癌细胞后其脾脏、骨髓以及外周血中中性粒细胞的数目未发生显著变化,表明中性粒细胞或许是Lin28B-high 乳腺癌特异性肺转的重要原因。

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当在接种肿瘤早期(模拟转移前肿瘤微环境)使用中和抗体抑制中性粒细胞在肺部的浸润时,肿瘤生长未发生显著改变,但转移受到明显抑制,而晚期使用中和抗体其效果大大下降。综上,这些结果说明,中性粒细胞是Lin28B促进乳腺癌肺部转移前微环境形成的重要因素。


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当Lin28B表达增加时,其肺部中性粒细胞的N2极化也相应增加,说明Lin28B诱导的中性粒细胞的极化可能是其促进转移前微环境形成的原因。

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此外,Lin28B能显著促进细胞分泌IL-6与IL-10,并且IL-6与IL-10在体外能分别或协同介导中性粒细胞向N2型转化,表明Lin28B介导的IL-6/10可能是其导致中性粒细胞N2极化的因素。


同样,IL-6与IL-10在体内也能分别或协同介导中性粒细胞向N2型转化。

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当使用IL-6/10中和抗体干预IL-6/10蛋白时,发现Lin28B的促转移潜能消失,而使用IL-6/10重组蛋白处理荷瘤小鼠时,其转移能力显著增加,其转移能力随着中性粒细胞的清除而消失,从而说明IL-6/10的促转移能力依赖于中性粒细胞。综上,这些结果表明,IL-6与IL-10是导致Lin28B-high乳腺癌细胞肺转移的重要因子,使用中和抗体阻断其活性是抑制肺转的有效手段;IL-6/IL-10通过诱导中性粒细胞N2转化,从而促进乳腺癌肺转移。

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作者在发现中性粒细胞是Lin28B促进乳腺癌肺转移的重要因素之后,想深入探究Lin28B促进中性粒细胞极化后肺部免疫微环境的变化情况。他们发现,小鼠在接种Lin28B-high乳腺癌细胞后,转移前肺部T细胞含量显著下降,然而T细胞趋化因子水平未发生显著改变(T细胞趋化程度未变,增殖/活化减少?)。

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紧接着,作者进一步发现接种Lin28B-high乳腺癌小鼠肺部的N2型中性粒细胞能显著抑制CD4/CD8+T细胞的增殖,而transwell共培养系统未发生相似的现象(这可能是由于直接接触产生的效果)。

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同时,接种Lin28B-high乳腺癌小鼠肺部的N2型中性粒细胞能显著抑制CD4/CD8+T细胞的活化,而N2型中性粒细胞上清未发生相似的现象(直接接触产生的效果)。

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同时,作者发现接种Lin28B-high乳腺癌小鼠肺部CD4+T细胞的Th1分化显著减少,其可能是通过N2型中性粒细胞来抑制CD4+T细胞往Th1方向分化。

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由于前面发现,中性粒细胞对T细胞间的抑制作用是通过直接接触导致的,因而作者自然想到受体与配体间的结合。他们发现接种Lin28B-high乳腺癌细胞的小鼠肺部表达PDL2的中性粒细胞数目显著增加,而表达活化配体的数目显著减少。

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23.png结合前面结果,研究发现IL-6/IL-10是引起接种Lin28B-high乳腺癌小鼠肺部表达PDL2中性粒细胞数目增加的主要原因。

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体外实验证实,PDL2中和抗体可以恢复由N2型中性粒细胞引起的CD4/CD8+T细胞增殖抑制。

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同理,PDL2中和抗体也可以恢复由N2型中性粒细胞引起的CD4/CD8+T细胞活化抑制。

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然而,PDL2中和抗体不能恢复由N2型中性粒细胞引起的CD4+T细胞向Th1的分化抑制。

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外泌体是转移前肿瘤微环境形成的重要因素,因而作者利用Lin28B-high乳腺癌细胞来源的外泌体驯化小鼠,发现其可以模拟出与接种Lin28B-high乳腺癌细胞小鼠肺部类似的微环境(中性粒细胞增加、PDL2增加、N2极化以及IL-6/IL-10的产生)。


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类似地,利用Lin28B-high乳腺癌细胞来源的外泌体驯化小鼠,发现其也可以模拟出与接种Lin28B-high乳腺癌细胞小鼠肺部其他类似的微环境(CD4/CD8+T细胞数目减少,活性降低以及CD4+T细胞向Th1的分化减少)。

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利用Lin28B-high乳腺癌细胞来源的外泌体驯化小鼠后原位接种野生型乳腺癌细胞,发现外泌体可以显著促进肺转移,而PDL2、IL-6中和抗体可以显著抑制肺转移,与前期结果一致,进一步说明Lin28B上调的乳腺癌细胞能通过分泌外泌体促进肺转移。

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一致地,上述处理也能显著恢复Lin28B-high乳腺癌细胞来源的外泌体导致的T细胞数量减少,活性降低以及CD4+T细胞向Th1的分化减少。

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Let-7s与miR-125a被推断是外泌体中发挥作用的主要成分,通过重复前面的相关实验,作者发现Let-7a是外泌体建立免疫抑制性微环境的因子(IL-6/IL-10)。

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Let-7s与miR-125a被推断是外泌体中发挥作用的主要成分,通过重复前面的相关实验,作者发现Let-7a才是外泌体建立免疫抑制性微环境的因子(中性粒细胞数目、N2型极化)。

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Let-7s与miR-125a被推断是外泌体中发挥作用的主要成分,通过重复前面的相关实验,作者发现Let-7a才是外泌体建立免疫抑制性微环境的因子(PDL2+细胞占比、T细胞数目及活化、外泌体体内促转移效果)。

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通过临床样本验证,作者发现Let-7s在肿瘤中表达显著降低,且其水平随着乳腺癌恶性程度的增加而下降;低表达的Let-7s有着更低的生存期和更高的肺转移潜力;Let-7s与Lin28B的表达呈显著负相关。因此,Let-7s与Lin28B在表征乳腺癌肺转移及其预后方面具有一定的价值。

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全文研究思路概括图。