2022.01.11 贾文慧分享“基于锌离子干扰的肿瘤饥饿治疗纳米系统的设计”的故事

大家好，今天给大家分享的文章是由郑州大学的团队在去年12月才发表在advanced science上的一篇文章，这篇文章主要介绍了一种基于锌离子干扰策略的纳米肿瘤饥饿疗法。

先来给大家介绍一下这篇文章所用到的肿瘤饥饿治疗的策略，肿瘤饥饿治疗就是通过消耗肿瘤生长所必须的一些物质比如说葡萄糖、氧气或者是一些营养物质以及引起血管的收缩来减少肿瘤部位的血供来使得肿瘤细胞被饿死从而达到肿瘤治疗目的的一种肿瘤治疗策略。

相较于切断肿瘤的营养物质供给，切断肿瘤的血供是更受青睐的一种肿瘤饥饿疗法策略，因为切断肿瘤血供不仅可以导致原发灶出肿瘤细胞的生长受到抑制，并且可以切断肿瘤细胞通过血管向远端的转移。但是这种疗法也面临一些问题，比如说可能对正常组织中的血管也有所破坏，或者是由于肿瘤部位的血流速度较快，导致瘤内血管栓塞治疗的效果不理想等等。

而另外一种通过减少肿瘤细胞葡萄糖摄取而使得肿瘤细胞能量供应不足从而被饿死的疗法也是非常常用的，因为葡萄糖氧化酶GOD可以介导这一葡萄糖的消耗过程，所以GOD在肿瘤饥饿治疗中的运用也非常多，但是持久的、非靶向性的一个GOD的使用可能会导致低血糖，从而也在某种程度上限制了GOD在临床上的使用。

这篇文章它还运用到的一个背景就是我们都知道细胞中含有一些微量的金属离子，比如说钙离子、铜离子、锌离子等。这些金属离子可以去维持一些辅酶的功能从而维持细胞的一个正常代谢，而当这些金属离子含量超标的时候，就会对细胞的功能造成一定程度的损伤。因为钙离子、铜离子的超标对于细胞的杀伤作用都已经有了一些报道，所以这篇文章的作者主要关注的是一个锌离子的功能，并且近期有报道说过量的锌离子会损伤细胞内的线粒体功能从而抑制糖酵解，使得肿瘤细胞中的能量供应不足。并且由于锌离子它主要是损害NAD+来抑制糖酵解，糖酵解是肿瘤细胞中主要的能量来源方式，所以肿瘤细胞相较正常细胞而言，对于锌离子积累更加敏感，基于此，作者就设计了以锌离子干扰为核心的可以对肿瘤实现饥饿治疗的纳米粒子。

这个纳米粒子主要包括这几个部分，一个是我们已经比较熟悉的材料就是ZIF-8，它是一种含有锌的材料，在进入溶酶体之后受到溶酶体中较低的pH影响，会释放出锌离子。之前说过锌离子它会抑制细胞内的糖酵解过程，所以这时候细胞对葡萄糖的摄取量就会变大，细胞膜上的葡萄糖转运体GLUT1的表达上调，所以为了使得细胞更好的达到一个饥饿的状态，作者又设计了一种可以被锌离子活化的能够特异性切割GLUT1 mRNA的酶，而锌离子是作为这种酶的辅酶因子，使得这个酶在体内具有较好的酶活。最后给这个纳米粒包上了一层透明质酸HA的外壳，以实现对肿瘤的靶向。

所以这个多功能并且多重靶向的纳米粒子能够实现对肿瘤细胞更好的治疗效果，并且对正常组织及细胞的影响较小。

下面我们来看一下实验结果，首先是纳米粒的合成和表征，他们合成的方法没有什么特殊的地方，用到的主要方法就是搅拌和离心水洗纯化。

首先他们对合成的纳米粒子进行了表征，发现纳米粒的粒径为117nm，相较单独的ZIF-8和透明质酸包裹的ZIF-8的粒径都更小，可能原因是锌离子和DNAzyme发生了一个结合导致其粒径变小，并且成熟的纳米粒也有个更负的电势，有利于肿瘤细胞的摄取。之后他们又用电镜观察了一下纳米粒呈均匀的球状，元素光谱显示来自ZIF-8的锌元素和来自DNAzyme中的磷元素都均匀分布于整个纳米粒中。之后他们又通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对纳米粒中DANzyme的包封率进行了测定，发现最高可以达到81.5%。随后他们又运用热重分析的方法对HA的含量进行了计算，发现HA的含量为3.27%。因为在弱酸性的环境下ZIF-8结构会发生分解，使得锌离子以及其内容的DNAzymes被释放出来。所以之后他们在不同的pH条件下测定了纳米粒的紫外吸收，发现MOF结构确实是存在一个pH依赖的降解。

随后他们又运用电感耦合元素分析和质谱联用技术对于在不同pH值下锌离子和DNAzyme的释放量进行了测定，发现在pH6.8和pH5.5的情况下锌离子和DNAzyme的释放速率都要比pH7.4的生理条件下要快，呈现一个pH依赖的现象。电镜照片可以更加明显地看到纳米粒子在pH6.8和pH5.5中发生降解的过程，我们可以发现在pH7.4的情况下，HA的存在对于稳定这个纳米粒的形态起到了很好的作用，当没有HA时，纳米粒在pH6.8和pH5.5时的崩解速度也会加快，HA酶加速了锌离子和DNAzyme的释放。在肿瘤微环境中，也是一个弱酸性以及HA酶含量较高的一种情况，所以这就为作者设计的这个纳米粒子实现双门控以及多重靶向提供了条件。

接下来，作者为了看一下纳米粒子中锌离子的量是否能够为DNAzyme提供足够的辅酶因子去使得DNAzyme发挥它良好的剪切功能。为了测定这个DNAzyme它对于GLUT1 mRNA的剪切效率，作者用到的方法是FRET，也就是荧光共振能量转移的实验方法。我们看这个图也可以简单理解一下测定的原理，就是当锌离子存在时，荧光基团的供体和受体各自稳定存在，而当锌离子不存在时，由于没有实现一个mRNA的剪接，所以mRNA两端荧光供体基团和受体基团靠的足够近，使得能量可以从供体基团转移到受体基团，观察到的现象就是一个总荧光强度的减弱。所以当荧光强度越高时，DNAzyme的剪切效率越高。

荧光共振能量转移的实验结果显示DNAzyme对于GLUT1 mRNA的一个剪切效率呈现出一个很强的锌离子浓度以及时间依赖性，当锌离子浓度越高时，在相同的时间内的剪切效率越高。聚丙烯酰胺凝胶电泳实验也可以证明这一结论，并且这两个实验都显示当锌离子浓度为1μM时DNAzyme的剪切活性就能被启动，然后他们又通过之前的释放曲线计算出在pH6.8的时候四个小时左右，锌离子的释放量就能达到19.5μM，可以实现DNAzyme的一个全面激活。之后他们又验证了一下纳米粒对于GLUT1 mRNA的切割效率，发现在pH6.8和5.5的情况下，24小时左右就能实现对于mRNA底物80%左右的切割。

在对于纳米粒的物理化学性质进行表征之后，作者又对于纳米粒靶向肿瘤细胞以及其进入肿瘤细胞后逃逸溶酶体的能力进行了表征，他们是通过给DNAzyme带上了一个488的荧光标签来表征纳米粒的存在的，结果发现相较于正常的黑色素细胞PIG1来说，恶性程度较高的黑色素瘤细胞B16-F10对于纳米粒的摄取较好，在4个小时的时候就有较高程度的摄取，当加入CD44的抗体之后，在相同的时间内对于纳米粒的摄取会减少，这也验证了纳米粒外层包裹的HA对于肿瘤细胞有一定程度的靶向，之后他们又用流式对这一结论进行了验证。

在验证了肿瘤细胞可以对纳米粒进行有效摄取之后，作者接下来验证了纳米粒进入细胞后到达溶酶体的情况，发现在0.5h的时候纳米粒和溶酶体就开始出现共定位了，2h的时候共定位逐渐减少，这也反映了纳米粒在进入溶酶体之后被水解随后释放锌离子和DNAzyme的过程。同时，作者也通过电镜观察到在纳米粒处理的黑色素瘤细胞中也出现了溶酶体的崩解，以及纳米粒离开溶酶体腔的过程，证明纳米粒在进入细胞之后成功从溶酶体中逃逸。

随后，他们验证了纳米粒摄取是否会引起细胞内的一个锌离子浓度变化。他们对于纳米粒处理后的细胞裂解液进行提取，做了ICP-MS实验去测定每10000个细胞中锌离子的量，结果发现相较普通的PIG1细胞，恶性胶质瘤细胞B16-F10细胞内锌离子的波动程度更大，说明其对于锌离子更加敏感。之后他们又采用了游离的锌离子探针使得细胞内的游离锌离子可视化，结果发现恶性程度更高的B16-F10细胞相较PIG1细胞来说细胞内游离的锌离子浓度更高，这和ICP-MS实验的结果是一致的，红色的Dil探针表征的是细胞膜，当加入锌离子的螯合剂TPEN之后，蓝色荧光减少。之后他们又观察到在B16-F10细胞中存在时间依赖性的一个锌离子浓度的升高。

后续他们通过流式也验证了B16-F10细胞中出现了较为显著的锌离子的积累。

随后，他们对于为什么纳米粒对于B16-F10细胞的靶向能力更强进行了探索，发现恶性程度更高的B16-F10细胞膜表面CD44的表达水平更高，CD44作为HA的一个靶向位点，所以使得B16-F10细胞对于纳米粒有更大程度的摄取。

因为之前的结果也显示B16-F10细胞中的锌离子浓度比PIG1细胞中的本底锌离子浓度低，所以作者就想会不会是因为它们细胞内部的这种本底锌离子差异导致了它们对于锌离子的摄取不同，作者发现当B16-F10细胞在50μg/ml的纳米粒中孵育一时和PIG1细胞在80μg/ml的纳米粒中孵育一时时它们对于纳米粒的摄取基本是一致的，可是即便如此B16-F10细胞内部的锌离子浓度波动程度也更大，证明其对于锌离子的浓度变化更加敏感，这可能就是因为肿瘤细胞相比正常细胞内的锌离子水平更低，所以它们对于变化更加敏感。

并且有研究也发现在肿瘤细胞中，细胞膜上的锌离子转运蛋白ZnT1的表达量会下调，这个蛋白的作用就是将胞内的锌离子转运到胞外，由于肿瘤细胞中这个转运蛋白的表达量较低，所以可能也减弱了肿瘤细胞内锌离子的外排，使得肿瘤细胞内的锌离子浓度较高。所以利用锌离子从而对肿瘤细胞靶向主要是由于两个方面，一是肿瘤细胞相较正常细胞具有更低的本底锌离子水平，还有就是肿瘤细胞ZnT1锌离子外排蛋白的表达较低，来维持肿瘤细胞内较高的锌离子水平，这两个条件使得锌离子干扰这一设计在肿瘤细胞中得以实现，并且对于正常细胞的影响较小。

之后作者对于锌离子进入细胞后所发挥的生理功能进行了探索，也就是可以抑制细胞的糖酵解从而导致其死亡。从MTT实验的结果中可以看到单独的锌离子就可以引起细胞的一个死亡，在加入纳米粒之后，对于肿瘤细胞也有浓度依赖性的杀伤效果，如果加入ZIF-8降解后的另外一种产物二甲基咪唑之后，对于细胞生存率的影响较小，说明细胞死亡的绝大部分原因是由于锌离子所导致的，并且正常的PIG1细胞相较恶性程度较高的B16-F10细胞来说他对于纳米粒处理具有更好的耐受性。

因为之前已经有报道说锌离子的过载会抑制细胞的糖酵解过程导致肿瘤细胞的能量不足从而死亡，通过测定也确实发现纳米粒处理后的细胞中ATP水平下降，而NAD+是ATP产生过程中的一个重要底物，所以作者随后又测定了细胞内NAD+的含量，结果发现纳米粒处理也会导致细胞内NAD+含量的下降，如果同时加入锌离子的螯合剂，那么细胞内ATP的含量以及NAD+的含量都会有一个回复。后续他们又对NAD+生产过程中的限速酶NamPRT的含量进行了检测，发现纳米粒处理也会导致NamPRT的含量降低，导致NAD+的生物合成受损，一些需要NAD+来维持酶活的糖酵解过程中的重要代谢酶，比如说GAPDH的活性也相应的下降了。最后，他们又对糖酵解过程的两个重要产物，一个是乳酸还有一个是ATP的含量进行了测定，发现纳米粒处理会导致B16-F10细胞胞内乳酸和ATP含量的下降，当加入锌离子的螯合剂或者NAD+之后，这种降低会有一定程度上的回复，而纳米粒处理对于正常的黑色素细胞PIG1的糖酵解水平影响较小。

之后他们做了一些基因表达水平上的分析，对于纳米粒处理之后的细胞mRNA水平进行了分析，看纳米粒处理是否真的能够影响糖酵解相关基因的mRNA水平。他们对于处理组与非处理组细胞进行了RNA seq的实验，我们可以看到纳米粒处理组和对照组的RNA水平有较大的差异，后续对这些基因的表达量进行分析，发现表达量上调的基因有1240个，表达量下调的基因有1321个，说明纳米粒处理确实能显著影响细胞的基因表达变化。之后他们对于这些基因进行了分析，发现下调的基因基本属于糖酵解通路，比如说和NAD合成以及电子传递相关的一些基因，说明纳米粒处理确实能影响细胞的糖酵解通路。而上调的这些基因多是一些和锌离子代谢相关的基因，说明纳米粒处理确实打破了细胞内的锌离子稳态。

后续他们对于这些基因所属的通路进行了分析，发现这些基因所属的通路下调的也是和糖酵解、代谢、电子传递等相关的通路。所以以上的这些结果都说明纳米粒是通过抑制细胞的代谢从而导致其饥饿的一种方式来达到对细胞的治疗目的，在这个过程中锌离子起了非常重要的作用。

接下来作者去验证了在糖酵解相关信号通路被阻断后细胞内的能量确实减少了、细胞确实处于一个饥饿的状态。他们首先是用qPCR去验证了一下GLUT1基因的表达水平，发现在包裹GLUT1的DNA酶之后细胞的mRNA水平确实是会有所下降，这个HZ@RD是他们包了一个random的核酸序列来作为对照，L@GD是选用了脂质体对GLUT1 的DNA酶进行包裹，由于没有足够的锌离子来维持DNAzyme的酶活，所以这一组GLUT1的mRNA水平也没有什么变化，WB和免疫荧光进一步验证处理之后GLUT1的蛋白水平也有所下降。

后续他们又通过免疫荧光实验直观看到了纳米粒处理会导致细胞葡萄糖摄取的减少，糖酵解的产物乳酸还有ATP的水平会下降，细胞的存活率也下降了，会引发细胞由于饥饿所导致的凋亡。

最后他们对于纳米粒的体内抗肿瘤能力进行了验证。他们首先对于纳米粒在生物体内的富集进行了验证，在ZIF-8纳米粒中包载了光敏剂IR783，发现纳米粒能够在肿瘤部位富集，有HA修饰的纳米粒对于肿瘤部位的靶向能力更强，并且能够在肿瘤部位停留较长的时间。随后他们又通过ICP实验对于小鼠各个组织中的锌离子浓度进行了定量分析，发现锌离子在肿瘤部位也是有比较高的富集，锌离子探针也显示纳米粒能够导致锌离子在肿瘤部位的大量积累。

随后他们又进行了抑瘤实验，发现纳米粒能够显著抑制小鼠体内的肿瘤生长，对于肿瘤组织的HE染色显示纳米粒能够显著破坏肿瘤组织的结构，对于肿瘤的生长有显著的抑制作用。

在验证了纳米粒在体内具有较好的抑瘤效果之后，作者们又在体内对纳米粒抗肿瘤的机制进行了进一步的验证。首先是用TUNEL实验发现在纳米粒处理之后的肿瘤组织中有更大比例的肿瘤细胞会发生凋亡。免疫荧光实验也显示纳米粒处理使得肿瘤组织GLUT1的表达量降低，葡萄糖的转运减少，后续通过qPCR实验也进一步确认了这个结论。对于组织中乳酸和ATP的含量进行测定，发现也是下降的，这和之前对于纳米粒机制的探索是相符的。说明纳米粒能够通过降低肿瘤细胞中的GLUT1基因的表达来降低肿瘤细胞对于葡萄糖的转运，使得肿瘤细胞处于一种饥饿的状态，从而达到治疗的目的。