2021.09.28 刘波分享“NEDD4介导的选择性自噬调控TBK1稳定性以平衡宿主防御”的故事

固有免疫是宿主防御入侵机体的病原微生物的第一道防线。机体感染病毒后，通过细胞膜上模式识别受体识别病毒的病原相关分子模式，从而快速启动固有免疫和产生抗病毒反应，抑制病毒的复制和清除入侵的病毒。TBK1是细胞抗病毒免疫的关键激酶，当感知危险信号后被激活，并进一步磷酸化转录因子IRF3和使其入核，诱导下游干扰素的产生，从而发挥抗病毒免疫反应。其中，TBK1作为细胞固有免疫抗病毒信号通路的中心节点，如果其活性不受控制，可能导致自身免疫疾病和慢性炎症等疾病。近期中山大学崔隽教授团队发现在病毒感染后期NEED4诱导TBK1发生K27型多泛素化，再通过货物受体NDP52转运至自噬体进行降解，从而有效平衡了宿主细胞的免疫防御，防止出现过度免疫反应损伤机体（图1）。

首先，在293T细胞中异位表达NEDD4可以显著抑制ISRE、IFN-β和IRF3的表达。而敲低或敲除NEDD4后ISRE，IFN-β和IRF3表达增加。同时，研究人员还发现过表达NEDD4可以使干扰素刺激基因mRNA水平下调，而使病毒P RNA表达上调。然后，通过构建VSV-eGFP，发现细胞过表达NEDD4后荧光强度明显增加，以及流式细胞计数也证实带荧光的细胞数量明显增多。本组实验表明NEDD4负调控干扰素信号通路并促进病毒复制和感染。见图（2）。                                    

作者对NEDD4缺陷和WT型A549细胞在感染病毒后行RNA测序，通过差异表达分析鉴定出NEDD4缺陷细胞存在4216个基因表达上调和221个基因表达下调。然后再进行GO富集分析发现这些差异表达基因主要富集在细胞免疫反应通路，包括抗病毒反应通路。通过GSEA分析明确了I型干扰素通路，且大量干扰素刺激基因（ISGs）表达上调。本组实验明确了NEDD4通过控制病毒诱导的I型干扰素和ISGs表达负调控抗病毒反应。见图（3）。

为了明确NEDD4作用的分子靶点，作者把干扰素通路相关分子分别与NEDD4进行免疫共沉淀实验，结果表明NEDD4与TBK1和IKKi存在互作。进一步荧光素酶报告实验明确了NEDD4作用靶点在TBK1水平。同时，在感染病毒的293T细胞中分离出TBK1相关蛋白并行质谱检测，证实了NEDD4与TBK1存在互作。接着的IP实验证实在病毒感染后NEDD4 和TBK1互作明显增；同样的结果在共聚焦实验中得到验证。然后，作者构建了NEDD4截短突变并行IP实验，发现NEDD4的HECT结构域在NEDD4与TBK1互作中发挥重要作用。本组实验阐明了NEDD4在干扰素信号途径的作用靶点和在病毒感染后结合力增强以及NEDD4的HECT结构域的重要性。见图（4）。

为了明确NEDD4对TBK1的调控作用。过表达NEDD4促进了TBK1降解，而敲除或敲低NEDD4降低了对TBK1的降解。而NEDD4的催化失活突变体HA/CA不能使TBK1降解，同样，TBK1自磷酸化缺失突变体S172不能被NEDD4结合和降解。然后，分别通过药理抑制剂和基因敲除方法验证了NEDD4诱导TBK1降解是通过自噬途径实现。最后，在环己酰亚胺追逐实验中进一步验证了在BECN1和ATG5敲除中TBK1降解受到抑制。本组实验说明了NEDD4促进了TBK1通过自噬途径降解。见图（5）。

为了明确是那种货物受体介导了TBK1发生自噬降解，作者对选择性自噬途径常见的货物受体分别与TBK1或NDP52做了CO-IP实验， 结果发现它们分别与p62, NDP52和OPTN均有互作。然后对这三个分子进行敲除处理，荧光素酶报告实验明确了NDP52介导TBK1发生自噬降解。然后，过表达NEDD4 可促进NDP52与TBK1结合；而敲低NEDD4显著降低了TBK1 与 NDP52的结合。最后，发现NDP52泛素相关结构域（UBA）突变体DR/CK与TBK1亲和力下降。本组实验明确了TBK1由NDP52介导发生自噬降解，且NEDD4正调控TBK1与NDP52的结合，其中NDP52的UBA结构域在TBK1与NDP52结合中发挥重要作用。见图（6）。

为了探究NEDD4是否直接促进了TBK1泛素化以及泛素化类型。过表达NEDD4特异性增加了TBK1发生K27型多泛素化。质谱分析进一步证实了细胞在病毒感染后很容易检测到K27型多泛素化的TBK1。有趣的是，TBK1出现 K27型多泛素化多在病毒感染12小时后。病毒感染后过表达NEDD4可以促进TBK1泛素化；而敲低NEDD4可降低对TBK1的泛素化。且NEDD4需要依赖于其催化活性才能促使TBK1泛素化。本组实验证明了NEDD4诱导TBK1发生K27型多泛素化，并且NEDD4正调控TBK1泛素化过程。见图（7）。

作者为了进一步探究TBK1泛素化位点，首先对TBK1进行截短突变处理，然后明确TBK1的ULD结构域在起关键作用。再对ULD结构域行质谱分析，明确了k344位点是泛素化位点， 其在NDP52介导的TBK1 自噬降解途径中起到关键作用。对K344位点进行点突变，就阻断了TBK1泛素化，也不能与NDP52结合并被自噬降解。同样，k344点突变也废除了NEDD4负向调节干扰素信号通路的作用。见图（8）。

总结，作者阐明了NEDD4促进病毒感染和出芽的分子机制。首先NEDD4作用于干扰素通路关键激酶TBK1，促使其发生k27型泛素化，再通过下游货物受体NDP52介导k27型泛素化的TBK1发生自噬降解，从而起到抑制干扰素通路和抗病毒免疫作用，结果就导致了病毒的复制和感染增强。同时，作者也解析了TBK1泛素化位点在k344上，该位点突变将逆转NEDD4负调控干扰素途径的作用。