2021.09.22 樊清馨分享“利用多组学鉴定LRG1为肿瘤转移相关蛋白”的故事

转移是影响恶性肿瘤死亡率的主要原因,然而目前对于肿瘤进展机制了解是最少的。肿瘤种子细胞成功的转移与血管内皮细胞的功能密切相关。在过去的十几年，血管内皮细胞逐渐被发现积极参与肿瘤微环境以及肿瘤细胞的调控。最近研究发现，活化的血管龛可以通过ANG2激活STATS来促进血管炎症的发生。而当利用基因敲除/抗体等手段拮抗ANG2 / STATS之后，发现血管炎症明显被抑制，同时肿瘤的转移几率也明显降低。在这篇文章当中，作者利用多组学鉴定出内皮细胞特异性血管生成因子LRG1可以协助肿瘤细胞的转移。LRG1的表达与肿瘤引起的全身炎症有关，循环的LRG1升高可以通过增加肺血管周细胞数量促进转移。术前/术后使用LRG1阻断抗体均可抑制小鼠的转移并延长小鼠总生存期。该项研究确定了LRG1作为抗肿瘤转移靶点，具有一定的临床转化潜力。

首先，为了观察内皮细胞在不同肿瘤发展阶段内皮细胞内分子水平的变化，作者构建了一个手术转移模型：其中包括健康对照组（d0），C57BL/6N 小鼠中皮下接种肺转移性肿瘤细胞 [Lewis 肺癌 (LLC)]作为原发瘤组（d15），原发肿瘤切除术后1周 (d22)以及术后切除转移模型（d36）。在各时间点取肺内皮细胞进行全转录组分析。差异基因表达分析显示，在疾病进展时，ECs的转录激活，大部分基因与蛋白质分泌、炎症反应、缺氧和细胞增殖的标志基因集有关。同时，还观察到肿瘤的发生引起了全身的炎症反应。与d0相比，d15肺组织中有较强的免疫细胞浸润，特别是骨髓细胞浸润。在第22天观察到炎症基因和相应的浸润免疫细胞的表达急剧下降，提示原发性肿瘤切除术后炎症消退。因此，作者的所使用的这个转移模型真实地捕捉了肿瘤细胞驱动的全身炎性变化（图1）。

为筛选内皮细胞中与肿瘤转移相关的因子，作者利用基因本体论分析发现转录变化的这些基因富集于血管生成、细胞活力和转移相关基因集。结果发现LRG1是血管生成相关基因集当中表达差异最大的基因之一。且LRG1的表达与全身的炎症的时间模式密切相关，提示LRG1可能是内皮细胞对肿瘤的直接反应基因，血清学的结果也观察到了相似的结果。由于内皮细胞的STAT3信号已被报道可以调控ECs对炎症和转移的反应。同时，他们观察到STAT3信号在肺ECs中以疾病分期特异性的方式富集。为了研究STAT3是否能调控LRG1的表达，作者使用EC特异性STAT3基因缺失的小鼠模型发现STAT3的缺失强烈地破坏了荷瘤小鼠肺ECs中LRG1的表达（图2）。接下来，作者对LLC肿瘤进展分期的血清标本进行了蛋白质组学分析。发现LRG1与转录组学的检测结果一致。另外，在一些回顾性分析当中也发现LRG1在不同的实体瘤的血清当中上调(图3)。

为了确定循环当中LRG1的来源，作者测定了体外肿瘤细胞，原发肿瘤组织以及肺组织（d15）当中LRG1的表达水平，结果发现肿瘤细胞并不表达LRG1，肺组织较原发肿瘤组织有更明显的LRG1表达。然后作者从原发肿瘤和肺组织中分离了ECs、白细胞和CD31 - CD45 -细胞(包括上皮细胞、间充质细胞和肿瘤细胞)分别检测其中LRG1的表达水平，结果发现LRG1在白细胞与ECs中有丰富的表达，内皮细胞当中的表达水平更高（图3）。

为进一步了解分泌LRG1的责任内皮细胞，作者将各阶段肺内皮细胞进行了单细胞RNA-seq，结果发现LRG1主要由毛细血管内皮细胞与静脉内皮细胞分泌。上述结果提示LRG1在多个血管床的表达增强可能是导致循环中LRG1增加的主要原因（图4）。

为了分析LRG1在转移过程中的功能，作者利用皮下植入慢病毒过表达载体在LLC细胞中异位表达LRG1。结果显示循环LRG1浓度升高的小鼠黑色素瘤肺转移增加。同样，在实验性肝转移模型中也得到了同样的结论。上述结果表明LRG1的转移前作用并不局限于肺。为了进一步解释转移级联反应的确切步骤，作者在试验过程中切除LLC-pLenti/LLC- LRG1肿瘤来切断LRG1的供应后，LRG1对肿瘤的抑制作用也消失。提示LRG1的促转移作用主要发生在转移生长过程中，当LRG1来源停止时，该作用迅速丧失。为了研究LRG1对转移生态位的功能影响，作者对肺中不同基质群体进行了定量研究。结果发现LRG1并不影响ECs的增殖与免疫细胞的浸润与分化，提示LRG1的表达并不影响肺转移生态位上的血管生成和免疫反应。另外，利用多免疫荧光发现随着LRG1的增加，NG2+代表的肺血管周细胞数量增加（图5）。

为了研究LRG1-GOF对自发转移的影响，作者追踪了注射LLC-pLenti或LLC- LRG1细胞的小鼠转移进展。在原发性肿瘤切除2周后分析肺，结果发现LRG1-GOF小鼠转移负荷的增加。随后利用LRG1-KO小鼠研究LRG1-LOF对自发转移的影响，结果发现LRG1-KO小鼠肺转移负荷降低。总体而言，GOF和LOF实验都支持LRG1在转移过程中发挥关键作用（图6）。

为了评估在转移过程中阻断LRG1的治疗潜力，我们在LLC和MMTV-PyMT两种自发转移小鼠模型中使用LRG1-中和抗体15C4作为术后辅助治疗。在原发肿瘤切除后1天开始给予15C4或对照IgG。在LLC模型中，长期辅助治疗降低了肺转移负担，并延长了小鼠的总生存期8.5天，这与对照组IgG治疗组相比改善了约40%(图7)。Anti-LRG1(15C4)作为单一疗法在LLC模型中提供了显著的总体生存优势。同样，在乳腺癌(MMTV-PyMT)转移模型中，与IgG处理的小鼠相比，术后辅助给予抗LRG1 (15C4)的小鼠中位生存期几乎增加了一倍。在停止抗LRG1 (15C4)治疗后，有一部分小鼠发生了肺转移，这表明LRG1中和可以延缓先前播散的肿瘤细胞在肺中的生长。在术后辅助治疗中中和LRG1可抑制转移，从而在临床相关转移模型中提供实质性的生存益处（图7）。

总结：

该篇文章作者利用肺转录组学和血清蛋白组学的比较分析识别了肿瘤分期特异性血管生成因子LRG1。并利用单细胞测序鉴别出LRG1的来源。LRG1的上调明显促进了肿瘤细胞的远处转移，内皮细胞当中LRG1的敲除也降低了肿瘤转移的发生率。抗LRG1抗体（15C4）的使用成功增加了肿瘤术后切除模型的存活率。该实验结果提示LRG1可能是抗肿瘤转移的新靶点，抗LRG1抗体有望进入临床成为新型抗肿瘤策略。