2022.07.17 曹将军分享“HNSCC 来源的细胞外囊泡”的故事
头颈鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见的癌症，其主要包括颈部肿瘤、口腔颌面部肿瘤及耳鼻喉科肿瘤，约占头颈部肿瘤的90%。在确诊的病人中，大概有60%的患者为局部晚期阶段，并且50%的患者已发生局部和远端转移。因此，进一步探索HNSCC 的相关机制对于患者的治疗意义重大。肿瘤免疫微环境重塑被认为是HNSCC进展中介导肿瘤细胞免疫逃逸、转移以及耐药的原因之一。近年来，多种肿瘤细胞分泌的外囊泡被证实对于肿瘤微环境的重塑具有重要的作用。癌细胞来源的外囊泡能够携带多种蛋白或RNA 分子，当其被巨噬细胞、T 细胞和中性粒细胞等免疫细胞摄取后能够诱导免疫细胞功能发生改变进而介导免疫抑制微环境的形成。那么HNSCC 来源的细胞外囊泡是否对于肿瘤免疫微环境具有类似的功能呢？作者带着这一问题开始了下面研究。
首先，作者通过超速离心法提取了肿瘤以及癌旁组织细胞来源的小细胞外囊泡（sEVs）（图a），并对其形态、大小以及sEVs 的蛋白标志物进行了检测（图c-e），通过实验结果我们可以看到文中所提取sEVs 的形态和大小符合之前报道的范围，并且表达CD9、CD63、HSP90 等蛋白标志物。随后，为了揭示不同来源的外泌体所携带的蛋白有何差异。作者对正常组织细胞来源、转移性HNSCC来源以及非转移性HNSCC来源的sEVs 进行了质谱分析，通过分析结果发现CD73 在肿瘤来源的外泌体中富集（图f-g）。随后作者通过收集临床上6个病人的正常组织和肿瘤组织中的sEVs ，并通过WB 实验验证了上述结果（图h）。上述结果证明了CD73 在HNSCC 细胞sEVs 中的高表达，那么CD73 会被何种细胞吸收，又会对受体细胞产生何种影响呢?带着这个疑问作者进行了后续的探索。
利用TCGA 数据库分析结果发现，HNSC 肿瘤与其正常组织相比显著高表达CD73 编码基因NT5E （图A）。并且，高表达NT5E的患者与低表达患者相比，其总生存期显著缩短（图B-C）。随后，作者利用临床HNSCC肿瘤样本中CD73的表达量比对患者肿瘤的恶性程度发现，CD7 3高表达的HNSCC患者恶性程度显著增高（图a-b）。那么， CD73 的高表达会影响微环境的何种细胞呢？作者通过免疫浸润分析发现，NT5E 的表达与巨噬细胞显著相关（图c）。
作者利用细胞共培养体系发现，与对照组相巨噬细胞在与正常HNSCC细胞以及过表达NT5E 的共培养时，均能增加其CD73 的含量。而与 RAB27A 敲除以抑制 sEVs 释放的细胞共培养的巨噬细胞相比，其 CD73 含量与正常对照组相当，证明了巨噬细胞中的 CD73 含量增加主要是通过sEVs 递送（图a-b）。与此同时，巨噬细胞CD73 的含量与M2 型巨噬细胞细胞含量呈显著正相关。随后作者还发现，当巨噬细胞CD73含量增加时，其细胞摄取能力也显著增强（图c），同时分泌促癌炎性细胞因子 IL6、IL10、TNFα、TGFβ能力显著增加（图e-f），预示 CD73 巨噬细胞具有更强的促瘤作用。流式分析显示（图 h），sEVs 使巨噬细胞免疫检查点（PD-1，PD-L1，LAG3等）表达上调，表明 CD73 巨噬细胞可发挥更强的免疫抑制能力。以上结果表明，HNSCC 细胞分泌的sEVs所携带的CD73能够促进巨噬细胞往M2型极化最终介导免疫抑制的产生。然而，其功能在体内是否一致呢？
通过动物皮下瘤实验我们发现，与注射正常 SCC7 细胞的对照组相比，不管敲除 SCC7 细胞中RAB27A或者加入 Lat A 均能够显著抑制肿瘤的生长，而瘤内注射包含 CD73 的sEVs 能够显著恢复敲除 SCC7 细胞中RAB27A后对肿瘤生长的抑制作用，而注射不包含 CD73的sEVs则没有回复作用（图a-d）。同时，流式分析结果显示，sEVs 可招募巨噬细胞、Tregs 细胞，而 CD8 T 细胞浸润数目减少。此外，在瘤内注射了含 CD73 的 sEVs 后，这些免疫细胞尤其是巨噬细胞表面 CD73、PD-1 的表达水平均有所增加（图e-g）。此外，为了进一步验证sEVs中 CD73 的含量对老鼠皮下肿瘤生长以及免疫抑制微环境形成的作用，作者构建了小鼠骨髓来源高表达 CD73 的细胞系，并提取了对应的外泌体。通过实验结果同样证实，sEVs 中 CD73 能够促进小鼠皮下瘤的生长以及免疫抑制微环境的形成（图h-n）。以上结果说明，该体内实验结果提示，sEVs 可诱导免疫抑制，从而促进肿瘤细胞免疫逃逸。那么，sEVs中的CD73作用巨噬细胞的具体机制是什么呢？ 通过转录组测序结果发现，
M2 型巨噬细胞在 HNSCC 来源的sEVs 处理后共有143个差异表达的基因（图a），而NFκB1是与这些差异表达基因最为相关的转录因子（图b），最后富集分析结果证实NF-κB通路富集最为显著（图c）。随后，作者通过在两组不同HNSCC 来源的sEVs处理 M2 型巨噬细胞的组内进行了GSEA 分析，同样得到了上述结论（图d-e）。最后，利用荧光共定位实验以及WB实验，作者进一步验证了CD73被巨噬细胞摄取后能够激活其NF-κB通路，最后导致免疫抑制性巨噬细胞的形成（图f-h）。 在揭示
HNSCC来源sEVs 携带的 CD73 如何调控巨噬细胞，并介导免疫抑制微环境形成后，作者将研究的方向转移到了临床应用当中。通过从 HNSCC 患者血清中分离 sEVs，并利用ELISA 检测发现患者血清中sEVs 携带的CD73 含量高于健康人血清 sEVs （图a-c）。并且与肿瘤转移能力和大小显著正相关（图d）。此外，该探究还利用通体内实验进一步评估 sEVs 敲除联合抗 PD-1 药物对在小鼠体内治疗HNSCC的作用。结果表明，当 sEVs 中 CD73 敲除时，PD-1抗体的治疗效果发生明显的改善（图 f-k）。并且对肿瘤细胞进行流式分析后发现，在接受抗 PD-1 药物后，巨噬细胞、Tregs 细胞的浸润数量有所下降，CD8 T 细胞的数目增加。同时，免疫细胞表面的 CD73 和 PD-1 表达下降，说明联合治疗对于缓解肿瘤免疫抑制微环境有一定的促进作用。 综上所述，本文主要验证了HNSCC细胞来源的 sEVs 携带的 CD73 能够通过 TAM 介导免疫抑制并减弱抗 PD-1 的治疗效果。并且还发现sEVs 中CD73的含量可预测 HNSCC 患者的生长和转移，是潜在的抗 PD-1 联合免疫治疗靶点。
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