2022.11.11 陈阳分享“表观遗传学—m6A”学习心得体会

N6-甲基腺苷（m⁶A）最早在20世纪70年代的人哺乳动物细胞中发现，是腺嘌呤（A）在RNA或DNA上第6位氮原子处发生的甲基化修饰，其主要发生在RNA中。现研究发现，m⁶A是大多数真核生物mRNA中最丰富的修饰，下述以mRNA为核心进行心得学习。

1. m⁶A的生理功能

m⁶A修饰有影响RNA剪切、RNA运输、RNA翻译和RNA稳定性的生理功能。在RNA剪切中，m⁶A可能通过①干扰剪接因子和mRNA之间的相互作用；②使A-U碱基配的稳定性降低，RNA二级结构受影响；③甲基转移酶或去甲基酶的相互作用，导致m⁶A水平影响剪接因子的基因表达。在RNA转运出细胞核中，m⁶A相关的去甲基化酶ALKBH5可能影响RNA的出核速度。在RNA翻译中，由于m⁶A修饰多发生在外显子处，在hnRNA剪切的成熟mRNA中仍保留的m⁶A可能影响mRNA的翻译。由于3’UTR包含mRNA降解所需的富含AU的元件（ARE），铁反应元件（IRE）和细胞质聚腺苷酸化元件（CPE）等重要结构域，而3’UTR是microRNA靶向的区域，m⁶A富集的3’UTR区域不能排除m⁶A有参与调控mRNA稳定性的可能性。一般来说，m⁶A修饰主要富集在mRNA终止密码子附近的3'UTR上，其具有RRACH的共有序列（R= G或A；H= A，C或U）。葡萄牙里斯本大学医学院LuisaM. Figueiredo研究团队发现16-mer基序作为顺式作用的基序是poly(A)尾中包含的m⁶A所必需的，当从VSG基因的3’UTR中去除16-mer基序时，能导致poly(A)尾部缺乏m⁶A，进而快速去腺苷酸化并导致mRNA降解^[1]。

2. m⁶A的调节因子

   m⁶A可通过组蛋白修饰的writers，erasers和readers/effectors进行调节。根据下图所示，m⁶A主要通过METTL3、METTL14和WTAP形成的甲基转移酶复合物在核苷酸上添上甲基。而m⁶A可通过去甲基化酶FTO和ALKBH5去掉核苷酸上的甲基。因此，m⁶A在一定情况下是可逆的。此外，m⁶A可通过YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3识别核苷酸上含有甲基的序列。

3. m⁶A的检测方法

m⁶A可通过LC-MS、meRIP-seq、meRIP-qPCR和m⁶AELISA等方法检测。LC-MS是最早检测m⁶A的方法，其操作比较繁琐。而meRIP-seq优点是方便快捷、成本低廉，可对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析，但meRIP-seq只能鉴定m⁶A高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。具体的一些实验检测方法比较可见下图。

4. m⁶A的研究思路

以Naturecommunications的一篇文章为例，XinyaoLin等^[2]主要研究了RNA的m⁶A甲基化修饰能通过对Snail蛋白翻译的调控影响癌细胞上皮间充质转化（EMT）的机制。在此研究中，他们团队首先通过甲基化酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5确定了EMT过程中有m⁶A的参与，其次通过一系列实验手段发现Snail的表达水平受m⁶A的修饰水平调控，但当METTL3敲除大幅上调Snail的RNA水平时，Snail的转录水平却没有发生变化，进而继续研究发现m⁶A一方面使SnailRNA变得不稳定，另一方面又大幅提高了翻译延伸的效率，叠加而影响了Snail的蛋白水平。他们团队接着思考了是哪一个m⁶A位点修饰引起的Snail的变化，发现SnailRNA 上鉴定出来的3个m⁶A修饰位点中，3'UTR 的2 个修饰位点对翻译没有影响，CDS上的修饰位点对翻译效率很重要。最终发m⁶A对Snail蛋白延伸效率的调控，依赖于YTHDF1对其CDS区m⁶A位点的识别，以及YTHDF1与eEF-2的互作。具体研究如下图：

总结：

   m⁶A修饰主要发生在mRNA中，其不仅可影响RNA的稳定性，还可影响RNA的剪切、运输和翻译的过程，并可通过m⁶A可通过组蛋白修饰的writers，erasers和readers/effectors进行调节。总之，m⁶A修饰调控机制复杂多变，了解m⁶A的基础知识和科研思路以期更好的探究m⁶A在机体中的作用，从而找到更多的靶点以应用于临床疾病。

参考文献：

[1] Viegas,I.J., de Macedo, J.P., Serra, L. et al. N6-methyladenosine in poly(A) tailsstabilize VSG transcripts. Nature 604, 362–370 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04544-0

[2] Lin,X., Chai, G., Wu, Y., et al. RNA m⁶A methylation regulates theepithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail.Nature communications, 10(1), 2065 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-09865-9