2022.06.30 李磊分享《植物外泌体研究报告》今天为大家带来了本次读书报告主题:植物外泌体研究报告。 这里简单介绍背景,内吞作用下,膜的凹陷形成早期内体,细胞内的细胞器如线粒体,高尔基体等不断给与早期内体cargo使其发育成熟,形成多囊泡(MBV),多囊泡有2种结局,一种与溶酶体结合形成自噬溶酶体,降解后参与新的细胞活动,一种是与细胞膜对接后释放出腔内体,释放出的腔内体就被成为外泌体,这是细胞间通讯的重要工具,发挥着非常复杂的生物学功能。 与哺乳动物的外泌体类似,植物也能分泌外泌体类似的结构,我们称之为植物来源的细胞外囊泡或外泌体样纳米囊泡,这里我们统一称之为植物外囊泡。植物外囊泡有3条合成路径:多囊泡途径,泡外主动细胞器路径(2010年发现植物的蛋白分泌复合体),液泡路径(植物中水的运动路径,通过细胞壁,质膜和胞质)),可以看到,与动物的外泌体电镜图相比,二者几乎一致,此外,植物外囊泡内容物,包括了很多生物大分子如蛋白,核酸,脂质等,其提取与纯化方式多样,最常用的也是利用超速离心机进行梯度离心。因而通过外泌体的研究方法来探索植物外囊泡的功能或开发新的治疗方式具有强有力的研究基础。 植物外囊泡可以利用NTA动态光散射,电镜,表征其粒径大小,形态及分散情况;利用蛋白胶,核酸胶,与薄层色谱来反应其内容物所含有的蛋白,核酸与脂质;而多组学技术是一个非常重要的分析手段,高通量的组学技术如基因组,蛋白组,代谢组或脂质组能够分析植物外囊泡中更多的组分,从而丰富相关的研究。 植物细胞外囊泡的研究近几年如火如荼的开展了起来,主要也集中在本身潜在的治疗作用研究,以及作为纳米递送载体的相关研究。今年6月,Cell发表了一篇特异性植物蛋白RDR1能够调控肿瘤细胞的microRNA,从而抑制肿瘤。作者最后也是通过纳米载体递送的方式将该蛋白当做一种治疗策略,减少潜再的毒副作用,改善其容易降解的限制。 今天分享也是聚焦植物外囊泡的治疗作用,作为递送载体的2篇文献。 本文主题是茶叶来源的外囊泡通过口服靶向炎性微环境,从而预防及缓解肠道疾病。 炎性肠病:全称非特异性炎症性肠病,包括溃疡性结肠炎与克罗恩病。炎性肠病的发生与基因,饮食环境均有密切关系。发病高,治疗过程艰难。针对炎症过度激活的生物制剂,如英夫利昔单抗,能有效缓解重度发作期溃结。但其抑制免疫活化带来的感染风险也大大增加。并且溃结癌前病变,有很高的的致癌风险,因而开发新型治疗策略,缓解溃结对医疗系统的压力是明确可行的。 茶叶全球最受欢迎的三大饮品之一,有非常广泛的人口基础。茶叶富含多酚和黄酮,多糖等成分,现有演技表面茶叶具有抗炎,抗肿瘤,抗氧化应激,降血脂等功效。而茶叶来源的外囊泡是否具有相关功能,这篇文献就做了相关研究 通过Graphic abstract,可以发现茶叶来源的外囊泡富含半乳糖,炎症条件下,巨噬细胞高表达半乳糖受体,所以茶叶外囊泡对炎症具有天然靶向性,通过口服进入肠道,能调控肠道微生态,恢复肠道黏膜屏障,发挥抗炎与抗氧化的作用,从而缓解肠道炎症,预防肿瘤发生。 首先作者利用蔗糖梯度离心,电镜及粒径表征,并且通过蛋白胶明确所提取的成分为茶叶外囊泡。 随后,作者对茶叶外囊泡进行了内容物分析,利用串联的HPLC,鉴定其发挥功效的潜在成分。脂质分析发现8%半乳糖的占有率,而半乳糖能靶向高表达的半乳糖受体的细胞,从而获得天然的靶向能力。对比茶叶的主要成分,多酚与黄酮,作者发现茶叶外囊泡仍然含有丰富的多酚与黄酮类成分,如具有抗炎,抗氧化应激,抗肿瘤的没食子酸,槲皮素与杨梅酮等,这为茶叶外囊泡的潜在的治疗作用奠定了物质基础 体外实验表明,茶叶外囊泡能被巨噬细胞高效的摄取,并且小叶来源的摄取效率更高,因为脂质分析中小叶来源的外囊泡高表达半乳糖,而炎症条件下,巨噬细胞高表达半乳糖受体。为了进一步验证半乳糖受体介导的靶向作用,作者外源性加入半乳糖,从而竞争性结合半乳糖受体,发现荧光强度明显的变弱,从而明确了巨噬细胞对茶叶外囊泡的摄取机制。 随后,作者利用LPS诱导了巨噬细胞活化模型,发现茶叶外囊泡干预能提高HO-1的蛋白表达,明显降低LPS诱导的ROS水平。并且,茶叶外囊泡能降低促炎因子TNFα,IL-6,IL-12的表达,提高抗炎因子IL-10的表达。显示出了其体外抗氧化应激与抗炎的能力。 为了明确茶叶外囊泡的体内靶向作用,作者首先建了DSS诱导的肠炎模型,利用Dio标记植物外囊泡,给与灌胃。荧光成像提示,茶叶外囊泡能成功富集在结肠,并且持续48小时,显示出了良好稳定性(抵御消化道pH变换的环境)与体内靶向能力。为了进一步明确炎症组织的靶向能力,作者对比了健康的结肠组织,发现肠炎组织能富集更多的荧光,而健康组织几乎不表达荧光,提示茶叶外囊泡的良好的炎症靶向能力。而体内主要脏器荧光提示植物外囊泡主要富集在肝脏,考虑原因是肝细胞也表达较高的半乳糖受体。 作者构建了3种DSS诱导的肠炎模型,分别模拟肠炎进展,发作,与预防的干预情况。最后结果表明,茶叶外囊泡对于肠炎的进展有较好的抑制作用,对于肠炎的预防与治疗也有一定的帮助。而模型表现为体重下降,疾病活动指数增加,结肠长度减少,以及过度免疫激活引起的脾肿大。而茶叶外囊泡能有效缓解这些症状。 随后,作者检测了组织中氧化标志物髓过氧化物酶(MPO),丙二醛(MDA)以及抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的表达,以及细胞实验验证的炎性相关因子TNFα,IL-6,IL-12,IL-10;但是抗炎因子与体外实验结果不一致,可能是因为体外实验不一样的条件,引起了炎症的过度反应,导致抗炎因子的代偿性增加。 组织染色表明DSS诱导的肠炎组织肠壁变薄,腺泡消失,黏膜完整性被破坏。而经过NTs干预后只出现了腺泡减少,或部分消失,提示对肠炎的缓解作用。免疫组化提示,组织的MPO在给与大叶NTs治疗后出现降低,并与正常组织相似,提示其体内抗氧化潜能。紧密连接蛋白ZO-1与粘液蛋白MUC2在治疗后明显增加,显示出NTs对肠道物理屏障与化学屏障的保护作用。 本身IBD的发生与肠道微生态也有非常密切的关系,所以作者对不同组别进行了肠道微生物组分析,发现茶叶外囊泡能回复,甚至增加DSS诱导肠炎的肠道微生态的多样性。肠道细菌中,厚壁菌门与拟杆菌门的比例能反映炎性肠病的状态,通常DSS能诱导厚壁菌门与拟杆菌门的比例增加,大叶与小叶茶叶外囊泡能有效降低厚壁菌门与拟杆菌门的比例,提示茶叶外囊泡潜在的肠道微生物的调节作用,能恢复肠道微生物的内稳态从而从塑肠道生物屏障。 随后作者探究了茶叶外囊泡在肠炎诱发肿瘤中的作用,利用AOM与DSS构建炎症诱发的肿瘤模型,经过干预后发现,脾重及器官系数均没有变化,但是肿瘤数目与大小明显减少,提示茶叶外囊泡对于肠炎诱导肿瘤的预防作用。 在组织层面上,通过组织切片与免疫组化进一步判定治疗前后的肿瘤变化情况。HE染色可以看出,DSS+AOM诱导的肿瘤模型,肠道组织明显变性,腺泡消失,构象改变,组织变得致密,而正常与治疗组能保留或部分保留正常的肠上皮结构。免疫组化提示与正常组与治疗组相比,AOM+DSS诱导肿瘤能显著提高Ki67的表达强度,经过治疗后Ki67表达强度出现明显下调,提示了茶叶外囊泡对肠炎诱发肿瘤模型的预防作用,这也为临床中IBD的预防治疗提供了参考。 作者也对小鼠体重,器官指数,肝肾功,消化道(胃,十二指肠,空回肠,盲猜,结肠),及主要脏器进行一些列安全性评估,结果也证实了天然茶叶外囊泡的安全性。这也为IBD及炎症诱发肿瘤的临床治疗提供了新的治疗策略。 最后,回顾一下,作者通过茶叶外囊泡靶向巨噬细胞高表达的半乳糖受体作用于病灶,发现其能并能够降低肠道ROS,MDA, MPO的表达,降低促炎因子TNFα,IL-6,IL-12的表达,提高抗氧化物GSH,抗炎因子IL-10的表达,回复肠道微生态,保护肠道屏障,展示出抗氧化应激与抗炎反应,从而了缓解肠炎进展,预防肿瘤发生。 第二篇文献主题是柠檬来源的细胞外囊泡作为递送载体克服肿瘤耐药的相关研究。 肿瘤耐药包括多种原因,如药物摄取减少,外排增加,药物灭活,靶点突变,通路改变等。ATP-binding cassette transporters (ABC):ABC转运蛋白,利用ATP水解释放的能量转运各种底物,包括糖,氨基酸,金属离子以及药物分子,是肿瘤耐药最重要因素之一。因而增加药物摄取,抑制P-gp功能,减少外排,增加ATP消耗或减少合成是实现克服肿瘤耐药的重要策略。 本文利用了柠檬外囊泡的特性,增加巨胞饮,钙网蛋白介导的胞吞,小窝蛋白介导的胞吞实现DOX(多柔比星)在肿瘤细胞内的聚集,克服P-gp介导的肿瘤耐药。 首先,作者利用10%血清模拟体内环境,168小时的孵育显示出HRED良好的稳定性,通过检测补体C3的释放,发现EVs能有效抑制补体系统的激活,逃避巨细细胞的清除,都提示出了柠檬外囊泡作为载体及合成的纳米药物良好的体外分布及稳定性。 随后作者通过wb检测了宫颈癌SKOV3/Dox(耐药细胞)与亲本细胞系整合素的表达,这保证了纳米药物的靶向作用(HR肽能靶向整合素)。随后利用流式与免疫荧光检测了耐药细胞对HRED的摄取,结果表明,与单纯Dox相比,HRED与ED能有效富集在细胞内,并且HRED有更高的摄取效率,这为克服耐药奠定了物质基础。细胞活力检测发现,相对于DOX,经过EVs包裹的纳米药物有更强的抑制效果,并且经过HR修饰后效率更高。 为了进一步检测了HRED的细胞毒性作用,作者检测了HRED对细胞周期,膜电位,及细胞凋亡的影响;发现HRED能有效将细胞周期阻滞在G2期,并能降低线粒体膜电位,从而增加耐药细胞凋亡。 随后作者通过体内生物分布,观察了HRED体内连续96 h 的分布与表达,并且构建了带有luciferase的细胞系具体标记肿瘤位置。体内分布可见其主要富集在肿瘤部位,这也得益于肿瘤细胞高表达的整合素。随后作者检测了组织切片后的荧光情况,结果与体内分布一致,这显示出了HRED良好的肿瘤靶向能力。 为了验证DOX入血后的滞留作用,作者利用大鼠的血浆构建了体外的滞留实验,利用荧光成像系统检测了DOX在血液中的保留,发现,HRED能明显延长DOX的半衰期,对比单纯的DOX,有高达8倍的缓释时间,证实了HRED改善DOX体内快速清除的缺陷,为克服肿瘤耐药奠定了基础。 体内抗肿瘤实验也提示,HRED能有效的抑制耐药肿瘤的生长 不仅如此,抑瘤实验与荧光成像表明,HRED还能有效的抑制耐药肿瘤转移, 随后,作者通过耐药肿瘤组织的免疫组化(IHC),探索了HRED促进凋亡,抑制增殖及血管生成的机制(上调Cleaved Caspase3,抑制Ki67及CD34表达) 接着作者通过了主要脏器的H&E染色,溶血实验以及肝肾功检测评估了HRED的体内安全性。 为了验证HRED的一个克服肿瘤耐药的机制,作者利用罗丹明模拟了药物外排的过程,发现带有Evs分组能减少药物外排量,抑制P-gp的功能,增加药物在胞内的滞留。荧光结果与Western blot表示,HRED不影响P-gp的表达,但却减少了小窝蛋白(CAV1)的表达(介导药物外排)。ATP是影响药物外排的重要因素,于是作者通过低温与ATP合成抑制剂氮化钠,来减少ATP的合成,发现耐药细胞对药物的摄取出现了明显的减少,作者进一步研究了这种潜在的摄取机制,分别利用了网格蛋白,小窝蛋白与巨胞饮的抑制剂确认这些路径是否参与了药物摄取。结果提示,三者均能抑制对细胞的摄取,并且小窝蛋白抑制剂的效率更高,这也与Wb的结果相符合。 进一步探索其机制发现CAV1与HRED在细胞内有明显的共定位,装载有DOX外囊泡药物则更多的是进入细胞核内,这暗示了CAV1参与了纳米药物的摄取,并帮助DOX入核。ATP的检测结果提示,柠檬外囊泡作为载体的纳米药物能降低ATP合成,并且能增加ROS的生成,但HR与DOX并不参与这个过程,因而被外排出细胞,到这里作者就讲明了HRED的克服肿瘤耐药的机制。 最后,我再来回顾一下。作者利用c端残端的RGD的三肽序列的多肽,连接上肝磷酯,进而连接上植物外泌体并装载DOX,这一过程抑制了补体激活,延长了药物在胞内的滞留,而肿瘤细胞高表达的整合素受体使纳米药物能靶向肿瘤细胞,肿瘤细胞通过小窝蛋白,网格蛋白介导的内吞摄取大量的药物,这一过程需要消耗ATP,进入细胞后纳米药物能抑制ATP的合成,抑制P-gp的外排功能,并且能激活ATP缺乏条件下巨胞饮对大分子的摄入,二次增加药物摄取。这些事件最终导致ROS的增加以及DOX在细胞内的累积,从而达到了对耐药肿瘤细胞的抑制作用。
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