2022.03.21 李琼“外泌体用于增强免疫治疗并重编程肿瘤微环境实现胰腺癌治疗”的故事
大家好，今天给大家分享的这篇文章是由复旦大学的蒋晨教授团队在2021年3月发表在Biomaterials上的论文：Pancreaticcancer-targeting exosomes for enhancing immunotherapy and reprogramming tumormicroenvironment
文章的通讯作者是复旦大学的蒋晨教授，她主要致力于脑靶向、肿瘤靶向等药物递送系统的设计、构建和评价的基础应用研究，近几年在国际主流刊物上发表了数篇文章。
首先，我们先了解一下外泌体的概念，外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。
人体中几乎所有类型的细胞均能产生外泌体，外泌体遍布我们全身，存在于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、精液、腹腔积液、关节滑液等生物体液中。并且，动物和植物的分泌物中也有外泌体存在。
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年， Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的 exosome可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。
在药物递送载体方面，外泌体的优势明显优于合成脂质体。①外泌体是由细胞主动向外分泌的细胞外囊泡，可以看作天然的脂质体，能够克服上述合成脂质体的局限性。②外泌体能够来源于生物体自身,因此免疫原性低，具有良好的耐受性,即使是异种来源的外泌体在治疗疾病方面也具有极大的安全性。③外泌体还能够透过血脑屏障进入脑内的血液循环，鼻内给药的方式可以使药物快速到达脑内病灶，为无创伤治疗脑内疾病提供了可能。④外泌体的粒径分布范围为40-100nm]。在实体瘤部位具有高通透性和滞留效应（EPR效应）。⑤外泌体具有内在的归巢特性，还可以进行人工修饰，使其表达特定分子或者提高靶向能力。
外泌体提取方法： ●超速离心法：目前外泌体分离的金标准，且为外泌体提取的最常用方法，方法成熟，适用于大体积样本。 ●沉淀法：操作简单，快速，回收率高。 ●超滤法：操作简单省时，可在低转速下得到外泌体，不影响外泌体的生物活性。 ●亲和层析法：保证外泌体形态完整，特异性高，操作简单，无需特殊昂贵的仪器设备。 上述几种方法，方法一、二、三提取的纯度不够，方法四提取的量不够，我们可以将这两组方法综合起来，先用方法一、方法二、方法三粗略提取外泌体，再用方法四提纯外泌体。 外泌体鉴定 据国际细胞外囊泡学会（ISEV）在2014年的提议，外泌体鉴定3个标志：透射电镜（transmission electron microscope，TEM）、粒径（Nanoparticle TrackingAnalysis, NTA）、蛋白标志物（Western Blot, WB）。 TEM：外泌体透射电镜分辨率为0.1~0.2nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，可观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形，如图1），同时可测量外泌体大小。 NTA：该方法能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。 WB：外泌体Western blot检测可含内参检测，外泌体中的β-Actin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，外泌体WB检测时可能会检测不到任何条带或者条带微弱。
肿瘤细胞受到外界刺激发生死亡的同时，由非免疫原性转变为免疫原性而介导机体产生抗肿瘤免疫应答的过程称为免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）。肿瘤细胞发生ICD的同时，会产生一系列的信号分子，此类物质被称为损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)，主要包括暴露在细胞表面的钙网蛋白（Calreticulin），肿瘤细胞向外界分泌的高迁移率族蛋白1（HMGB1），细胞释放的ATP分子以及热休克蛋白（HSP70，HSP90）等。ICD过程中释放的DAMPs能够和DC细胞表面的模式识别受体PRRs结合，启动一系列的细胞学反应，最终激活先天和适应性免疫反应。
半乳糖凝集素（galectin)是凝集素超级家族中的一个家族，广泛分布于各种动物体内。已克隆并命名的成员有 15个,结构上都有1或2个糖识别域,对β半乳糖苷有特殊的亲和力，在细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等许多生理和病理过程中发挥重要的作用。半乳糖凝集素9 （ Gal-9 ）是β-半乳糖苷结合凝集素家族蛋白，能与巨噬细胞表面的Dectin-1受体特异性结合，驱动巨噬细胞向M2表型分化，诱导免疫抑制。Gal-9的阻断可逆转免疫抑制，诱导CD4+T和CD8+T细胞活化，驱动巨噬细胞向M1表型分化，抑制肿瘤生长。
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命疾病，五年生存期低于6％。由于传统的治疗方法（如手术切除和化学疗法）收益有限，因此迫切需要PDAC的新疗法。近年来，免疫疗法被认为是癌症治疗的一种特殊策略，其特征在于活化的宿主免疫反应，伴随着肿瘤细胞的识别和消除。虽然免疫检查点抑制剂在白血病和黑色素瘤中取得了巨大成功，取得了巨大的发展，但令人遗憾的是，PDAC是一个例外，因为其独特的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和低免疫原性。
PDAC的TME具有极丰富的基质，几乎占据了肿瘤块的90％。免疫细胞在TME中并不罕见，并且包含接近50％的基质细胞成分，但是其中只有少数是抗肿瘤效应细胞。换句话说，大多数免疫细胞是被劫持的免疫抑制细胞，被迫促进肿瘤进展。这些抑制性免疫细胞，包括髓样来源的抑制细胞（MDSC）、M2极化的肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAM）以及调节性T细胞（Treg），他们之间建立了全面的相互作用，抑制细胞毒性T淋巴细胞的功能。在最近的临床前研究中，在TAM和肿瘤细胞之间发现了一种新的机制，显示出促癌作用。Galectin-9（gal-9）是凝集素的β-半乳糖苷结合家族的成员，在小鼠和人类PDAC中都高度表达。 Galectin-9与dectin-1连接，可将巨噬细胞驱动为M2型。galectin-9的阻断导致反向的免疫抑制，增强CD4+和CD8+ T细胞效应激活以及减少肿瘤生长。这表明gal-9作为PDAC免疫疗法中新型治疗靶标的潜力。 然而，即使对PDAC进展中涉及的各种机制有了解，PDAC TME中的特殊病理生物学障碍，如高固相应力、血管不足、几乎不可穿透的基质，限制了治疗反应。用于药物输送的生物材料的最新进展已经使疾病的治疗取得了显着进展，包括PDAC，例如伊立替康脂质体，在临床试验中据报道可显着提高PDAC患者的中位总体存活率。这显示了基于生物材料的药物递送策略作为对抗肿瘤的新方法的潜力。尽管囊泡状脂质体有望克服严峻的障碍并显着增加肿瘤组织中的药物蓄积，但令人遗憾的是，许多这些合成的递送系统稳定性差，并且会引起严重的副作用。
因此，研究人员选择了研究外泌体，一种天然衍生物载体，作为药物递送平台，在PDAC治疗中具有独特的优势，如纳米尺寸、可生物降解的特征和肿瘤归巢功能。外泌体（直径40-150 nm）是具有脂双层结构的细胞来源的膜囊泡，可作为细胞间的沟通者，并能够针对肿瘤递送化学治疗药物、蛋白质或基因。值得注意的是，外泌体还显示出改善的稳定性，增强的内吞作用和降低的体内毒性。研究团队发现，源自骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的外泌体在PDAC小鼠模型中显示出肿瘤归巢功能。这些证据表明，外泌体可以作为胰腺癌的的纳米级药物递送平台。对于自下而上的碘克沙醇蔗糖梯度分离，将 11.5 mL 不连续碘克沙醇-蔗糖梯度（40%–5% 碘克沙醇溶液，0.25 mM 蔗糖，pH 7.4）内置到 12 mL 超速离心管中。将重悬于 500 μL PBS 7.4 中的纯化外泌体添加到梯度顶部，然后以120,000 g 超速离心 16 小时。将梯度溶液从上到下分成 12 支管，每管 1 mL 液体，每管的密度通过折光仪评估。由于外泌体的密度范围为 1.13 至 1.19 g/mL，因此收集 6 号和 7 号管中的液体并加入 PBS 至最终体积为 20 mL。然后将溶液以 150,000 g 超速离心 2 小时。底部的托盘重新悬浮在 500 μL PBS 中，可在 - 80 摄氏度下储存。所有离心均在 4°C 下进行。将 Galectin-9 siRNA 电穿孔到外泌体中。至于递送 OXA，通过将奥沙利铂氧化为 OXA(IV)-OH，然后用 N-(2-氨基乙基) 马来酰亚胺修饰来合成前药形式(OXA-MAL)。 OXA-MAL 的成功合成通过 1H NMR 表征（图 S1）。随后，通过涡旋用OXA-MAL修饰EXO-siRNA（指定为iEXO）以制备iEXO-OXA。
作者发现，制备成功的iEXO-OXA具有良好的稳定性和粒径。电镜观察粒径较为合适，形态良好，电穿法没有破坏外泌体的形态。
尾静脉注射Bodipy iEXO OXA、Bodipy EXO和游离身体（作为对照），在指定的时间观察到三组小鼠IVIS系统的时间点（0、4、12、24和48小时）（图2a和图S7）。值得注意的是，近红外（NIR）信号在Bodipy iEXO OXA组和Bodipy EXO组的肿瘤部位，但随着时间的推移，在对照组中系统地分布，这证明外泌体具有特异性PDAC肿瘤靶向能力延长循环时间。整个肿瘤组织和其他主要组织采集器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏），显示类似的生物分布趋势（图2b和c）。此外，冷冻肿瘤切片用COL-1和α-SMA抗体（绿色）染色，分别代表细胞外基质和成纤维细胞。
如图2d–g所示，Bodipy iEXO OXA和Bodipy EXO（红色）可以是即使间质是致密的，表明外泌体的穿透能力。此外，在体外和体内测定了iEXO OXA的稳定性。
作者首先验证 gal-9 siRNA 处理的下调效果体外。 PANC-02 细胞与 iEXO 一起孵育 6 小时，设置 iLIPO（基于 Lipo6000™的 gal-9 siRNA 转染策略）作为阳性控制。 qPCR 和蛋白质印迹均显示相关结果，其中 iEXO 可显着降低小鼠 PANC-02 细胞中 galectin-9 的 mRNA 和蛋白质水平，与 iLIPO 相比具有更好的功效（图 3a 和 b）。为了进一步评估 iEXO 在体外巨噬细胞极化中的功能，将新鲜收集的小鼠腹腔巨噬细胞分别与经 iEXO 预处理的 IL-4、PANC-02 细胞和 PANC-02 细胞（PANC-02@iEXO 组）共孵育。流式细胞术分析的结果表明 iEXO 组中 M2 样巨噬细胞显着减少（图 3c 和 d），表明 iEXO 在驱动巨噬细胞抗肿瘤表型方面的功效。综上所述，iEXO可以有效下调PANC-02细胞中的靶基因，从而阻断肿瘤细胞与巨噬细胞之间的连接，防止巨噬细胞在体外极化。
随后，进行MTT试验以证明OXA基制剂的细胞毒性作用。在与OXA、EXO-OXA和iEXO OXA孵育后，观察到显著的细胞活力抑制（图3e）。通过Annexin-V/PI测定进一步研究了抗肿瘤效果，其中Annexin-V信号表示早期细胞凋亡，PI信号表示晚期细胞凋亡。来自显微镜的图像显示，EXO-OXA组和iEXO OXA组的荧光强度显著高于其他组（图3j）。对于定量分析，然后收集细胞，再悬浮，并通过FACS进行分析（图3f和g）。与OXA组（3.61%）相比，EXO-OXA组和iEXO OXA组的细胞毒性增强（分别为9.92%和13.8%）。同时，由于OXA通过阻断DNA合成影响细胞周期进程，因此检查了细胞周期阻滞实验，我们确认基于外泌体的生物平台仍然具有细胞周期抑制能力（图S11）。
ICD是一种细胞死亡模式，可用于通过细胞表面成分的变化（CRT暴露）以及可溶性介质（例如HMGB1）的释放来刺激针对肿瘤的有效免疫应答[38]。由于基于OXA的药物可以在肿瘤细胞中触发ICD，因此在用不同制剂短期刺激后，在显微镜下监测PANC-02细胞表面的CRT暴露，随后进行流式细胞仪分析。如图3k和图S12所示，在EXO-OXA和iEXO-OXA组中检测到最多数量的CRT染色细胞，表明这两组中ICD相关免疫原性增强。此外，在用EXO-OXA和iEXO-OXA处理后，还通过荧光显微镜检测到HMGB1从细胞核向胞浆的较高释放（图3l）。此外，HMGB1分泌增加在这两组中通过western blotting检测到PANC-02细胞进入细胞外培养基（图3h和i）。总之，基于外泌体的OXA递送系统可以提高化疗药物的细胞毒性并增强体外ICD反应。
受上述体外结果的启发，我们进一步评估了各种制剂对原位胰腺的治疗能力。荷瘤 C57BL/6 小鼠。植入萤光素酶后稳定转染胰腺的PANC-02细胞系，小鼠模型随机分为7组，分别注射磷酸盐缓冲液（PBS组）、吉西他滨（GEM组）、奥沙利铂（OXA组）、scrambled siRNA-loaded外泌体（ Scrbl-iEXO 组）、gal-9 siRNA 负载外泌体（iEXO 组）、OXA 前药修饰外泌体（EXO-OXA 组）和 gal-9 siRNA 和 OXA 协同递送外泌体（iEXO-OXA 组）每 3 天一次，持续 5 天次（图 4a）。联合免疫疗法 iEXO-OXA 产生了强大的抗肿瘤作用，导致肿瘤大小显着减小（图 4b）和肿瘤生物发光（* P < 0.05，图 4c 和 f），以及最长的寿命（图 4d 和图 S13），优于治疗 PDAC 的标准药物吉西他滨。相比之下，单独接受 iEXO 或 EXO-OXA 的小鼠未能抑制该模型中的肿瘤生长。此外，在整个研究中没有明显的体重减轻或器官毒性表明我们基于外泌体的制剂在体内的生物安全性（图 4e 和图 S19）。
探索令人满意的抗肿瘤机制iEXO-OXA 的疗效，肿瘤部位内的多个元素是进行了调查。首先，由于肿瘤细胞中 galectin-9 的下调，巨噬细胞极化为肿瘤抑制 M1 表型是通过 iEXO 或 iEXO-OXA 处理实现的（图 5a-d，g-h）。通过 FACS 和肿瘤切片的免疫荧光染色，在 iEXO 和 iEXO-OXA 组中观察到 M2-TAMs (CD45+CD11b+CD206+) 数量减少以及 M1-TAMs(CD45+CD11b+CD16/32+) 增加。这些变化被认为是对免疫抑制 TME。值得注意的是，其他研究也发现稳健galectin-9 在 PDAC 患者肿瘤部位和血清中的表达，表明 galectin-9 作为检测 PDAC 的新生物标志物的潜力 [9]。此外，据报道，galectin-9在其他几种不同影响的肿瘤中高表达。虽然增加的表达与肺腺癌的存活率降低有关，但高表达与乳腺癌的抗转移潜力以及肝细胞癌、胃癌和结肠癌等癌症的较低存活率相关[39-43]。这些发现表明该制剂在其他癌症中的潜在用途。其次，与 PBS、GEM 和 Scrbl-iEXO 组相比，OXA 组的肿瘤区域发现 ICD 反应增加，因为证实了更高水平的 CRT 暴露和 HMGB1 释放通过 CLSM 和蛋白质印迹，虽然不如 EXO-OXA 组突出（图 5e-h）。
PDAC免疫治疗的另一个障碍是免疫原性低下，这意味着胰腺肿瘤患者的瘤内效应T细胞很少。由于免疫治疗的抗肿瘤效果很大程度上依赖于肿瘤细胞毒性T淋巴细胞的浸润，因此迫切需要在PDAC中增强免疫应答，招募更多的杀伤肿瘤的免疫细胞。最近的研究表明，诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡（ICD）是诱导抗肿瘤免疫原性以支持免疫治疗的一种很有前途的策略。临床前报告表明，一些化疗药物能够诱导ICD反应。这些药物处理后，凋亡肿瘤细胞表面表达钙网蛋白（CRT），随后释放HMGB1并分泌ATP。CRT作为“吃我”信号，诱导树突状细胞（DC）吞噬死亡肿瘤细胞，HMGB1和ATP作为免疫刺激信号，启动树突状细胞成熟和抗原递呈，进一步激活抗肿瘤免疫应答，促进细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在TME中的浸润。因此，化疗诱导的ICD可能是触发休眠的先天性或适应性免疫反应、杀死肿瘤细胞的一种有前途的策略。 受上述工作的启发，研究团队设计了一种以PDAC为靶点的外泌体生物平台，用于增强免疫治疗和重编程TME。奥沙利铂（OXA）是FOLF-IRINOX方案中用于PDAC治疗的一种成分，它既可以触发胰腺肿瘤部位的ICD效应，又可以通过抑制DNA合成和修复来杀死肿瘤细胞。为进一步提高抗肿瘤作用，研究人员利用gal-9siRNA阻断galectin-9/dectin-1，逆转M2-TAMs引起的免疫抑制。在联合治疗中，外泌体作为OXA和siRNA的载体，有利于提高药物的传递效率、肿瘤归巢和作用时间。制备siRNA EXO-OXA（iEXO-xa）纳米颗粒后，体外和体内实验表明，iEXO-OXA可优先传递到肿瘤部位，激发抗肿瘤免疫，增强血液循环时间，对PANC肿瘤有显著的治疗作用。
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