2022.08.04 贾文慧分享“乳腺癌细胞分泌的细胞外囊泡通过打破胰岛素稳态来促进肿瘤生长”的故事

大家好，今天给大家介绍的这一篇是2020年5月份发表在NCB上的一篇文章，揭示了一种将乳腺癌与糖尿病联系起来的生物学新机制：乳腺癌细胞分泌的细胞外囊泡中的 miR-122 能够抑制胰岛素分泌，从而导致糖尿病，而糖尿病破坏了全身血糖稳态会反过来促进肿瘤生长。

这篇文章的通讯作者是来自美国加州大学圣地亚哥分校的一位华裔教授，她近年来的主要研究兴趣在细胞外囊泡、肿瘤干细胞等都均有涉猎，这是她近几年的一些论文发表情况。

下面为大家介绍一下这篇文章的研究背景。之前已经有研究显示，肥胖及Ⅱ型糖尿病均和更高的乳腺癌发病率及更差的癌症治疗效果相关。并且Meta分析也显示，患有Ⅱ型糖尿病的女性患乳腺癌的概率增加了20%-27%。

与此同时，也有流行病学研究显示，很多Ⅱ型糖尿病的病理表现也和乳腺癌的发病及治疗相关。

糖尿病和肥胖除了可能增加乳腺癌的发病率，在乳腺癌发生之后，也会对患者自身的胰岛素代谢产生影响。有研究显示，在乳腺癌确诊两年之后，患糖尿病的概率开始增加；确诊10年后，乳腺癌患者患糖尿病的概率比健康人群高20%。

因为乳腺和胰腺处于不同的部位，距离比较远，所以作者就推断乳腺癌细胞对于胰岛细胞还有血糖控制产生的这种负面影响可能是通过一种分泌型的介质（如：外泌体）导致的。

细胞外囊泡是一种由细胞释放到细胞外基质的膜性小囊泡，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程，广泛地存在于各种体液和细胞培养液上清中，并稳定携带了蛋白、RNA等一些重要的信号分子。

前期作者团队在15年发表于NCB的一项工作已经显示乳腺癌细胞可以通过分泌富含miR-122的外泌体来影响葡萄糖代谢从而促进乳腺癌细胞的转移。现在这个工作是他们的一个后续工作，作者又深入研究了外泌体包含的miR-122对于胰岛细胞乃至全身的一个胰岛素代谢产生影响的机制，从而为乳腺癌和糖尿病发病的联系提供了一个基础研究的支持。

接下来我们就具体看一下这个研究的相关内容。

作者首先给雌性的NSG小鼠进行了五周、每周两次的尾静脉注射外泌体，主要注射了正常乳腺细胞MCF-10A的外泌体；过表达miR-122的MCF-10A细胞的外泌体以及乳腺癌细胞MDA-MB-231的外泌体，发现外泌体的注射对于小鼠的进食量以及体重均没有显著影响。

而肝脏的转录组分析显示MDA-MB-231细胞的外泌体及MCF-10A/miR-122细胞的外泌体处理组胰岛素信号通路基因表达情况较对照组有显著差异。

后续作者又对胰岛素通路的下游，包括胰岛素受体底物信号通路，FOXO介导转录的一些基因和糖原代谢相关通路进行了检测，发现含有miR-122的外泌体处理组的小鼠肝脏中胰岛素通路下游的相关基因的表达也会受到影响。

随后又运用Western blot检测了肝脏组织中胰岛素通路相关蛋白活性形式的表达情况，结果发现经过富含miR-122的外泌体处理之后会导致胰岛素通路活性的下降。PAS染色显示富含miR-122的外泌体处理组阳性（紫红色）的部分减少，说明这两种处理使得小鼠肝脏糖原的积累减少。

之后他们对于肝脏中甘油三酯的含量进行了检测，葡萄糖在肝脏中主要转化成肝糖原，当肝脏中的糖原达到饱和之后，葡萄糖就转化成甘油三酯，实验结果显示后两组中肝脏中甘油三酯的水平也有所下降。

这些蛋白表达情况的变化说明，经过富含miR-122的外泌体处理之后抑制了小鼠肝脏内的胰岛素信号通路，之后作者对于胰岛素通路被抑制的相关表型进行了检测。丙酮酸耐受的实验，即小鼠经过18h的饥饿处理之后给小鼠腹腔注射丙酮酸钠溶液，在注射后的不同时间点去测定小鼠血糖的含量，因为丙酮酸是糖异生的底物，糖异生是细胞合成葡萄糖的主要来源，所以作者这里是先检测了外泌体处理对于小鼠机体的糖异生能力的影响，结果发现包含miR-122外泌体处理组小鼠血糖含量较对照组又显著的升高，说明miR-122还能从葡萄糖合成的源头去影响整个机体的葡萄糖代谢情况。

因为胰岛素信号通路被抑制可能导致胰岛素的分泌量降低，所以作者就去检测了一下血液中胰岛素及其相关的C肽的含量。发现MCF-10A/miR-122和MDA-MB-231细胞外泌体处理组小鼠血液中胰岛素和C肽含量下降，而另一种和血糖调节相关的激素胰高血糖素的含量并无显著变化。

之后又做了葡萄糖耐受实验，检验外泌体处理对于小鼠对葡萄糖耐受能力的影响，做法也是在对小鼠空腹处理一段时间后对其腹腔注射葡萄糖溶液，然后测定不同时间点的血糖浓度，可以观察到MCF-10A/miR-122和MDA-MB-231细胞外泌体处理组小鼠对于腹腔注射葡萄糖的耐受能力较弱。此外，小鼠空腹血糖含量的升高也能说明在含有miR-122的外泌体处理之后，小鼠体内的葡萄糖及胰岛素稳态被破坏。

而如果对MCF-10A/miR-122细胞外泌体组及MDA-MB-231细胞外泌体处理组给予外源的胰岛素，则可以回复含有miR-122的外泌体处理对于胰岛素信号通路的影响。

后续作者又做了ITT也就是胰岛素抵抗的实验，发现小鼠并没有产生胰岛素抵抗的状态，就是不是小鼠本身对于胰岛素的敏感程度发生了变化。并且在MCF-10A/miR-122及MDA-MB-231 细胞外泌体处理组小鼠血液中的胰高血糖素及饥饿素含量无显著变化，说明miR-122外泌体对于血糖稳态的影响主要是通过胰岛素相关信号通路，而不是通过其它可以调节血糖的通路。

在发现搭载miR-122的外泌体能够通过影响胰岛素的分泌从而打破机体的葡萄糖代谢稳态之后，作者对于miR-122外泌体影响胰岛素分泌的机制进行了探索。

因为胰腺上的胰岛是胰岛素分泌的主要部位，所以随后作者又对外泌体处理后的小鼠的胰岛进行了转录组的分析，结果发现许多和抑制糖酵解相关的基因相较对照组有差异表达。

因为之前的研究已经显示miR-122能够通过靶向丙酮酸激酶M来抑制成纤维细胞和星形胶质细胞的糖酵解从而促进乳腺癌的肺转移，因为在我们这种外泌体处理的动物模型中也观察到了类似的现象，所以接下来作者就想去检测一下PKM的含量，看PKM是否能够成为连接miR-122外泌体和葡萄糖稳态的桥梁。

结果发现MDA-MB-231和MCF-10A/miR-122细胞的外泌体处理都下调了在胰岛中主要表达的丙酮酸激酶亚型PKM2，而较少的亚型PKM1也有类似的变化，另一种亚型PKL由于含量过低并不能检测到它的明显变化。

之后作者利用密度梯度离心的方式分离外泌体，选择了miR-122和外泌体marker共富集的组分。给小鼠尾静脉注射MCF-10A/miR-122细胞的外泌体和MDA-MB-231细胞的外泌体会引起小鼠血清中miR-122含量的上升。说明采取这种方法提取出的确实是含有miR-122的完整的细胞外囊泡的结构。

随后作者对于胰岛β细胞对于外泌体的摄取情况进行了探索，无论是流式结果还是荧光照片均显示胰岛β细胞对于外泌体能有效摄取。接下来，利用两种抑制剂对于胰岛β细胞中miR-122水平升高的原因进行探索。发现采用内吞作用抑制剂处理时能够显著抑制胰岛细胞内miR-122水平的升高。说明胰岛细胞内miR-122水平的升高是由于细胞对于外泌体的摄取，而不是细胞对于miR-122的转录增强了。

MCF-10A/miR-122和MDA-MB-231细胞外泌体处理胰岛β细胞会降低PKM的表达，丙酮酸激酶的活性下降，ATP含量下降，ATP/ADP比值下降，糖酵解强度降低。

质膜钙离子泵需要糖酵解供能，所以糖酵解强度的下降也会引起细胞内钙离子浓度的降低。作者们对细胞内不同时间点的钙离子浓度进行测定之后发现MCF-10A/miR-122和MDA-MB-231细胞外泌体处理会导致胰岛β细胞内钙离子含量降低、细胞耗氧量降低、胰岛素分泌量减少。

作者随后又发现，在敲低PKM2后，胰岛细胞内ATP含量及胰岛素分泌量的变化和含有miR-122的外泌体处理之后的变化是类似的。

随后他们在体内实验中对这一结论进行了验证，结果发现乳腺癌来源的miR-122外泌体通过靶向PKM来降低丙酮酸激酶的活性，降低ATP水平，使得胰岛素分泌量减少。

所以在这一部分作者就通过体内外实验验证了乳腺癌来源的miR-122的外泌体通过靶向PKM来降低丙酮酸激酶的活性，抑制胰岛β细胞的分泌，胰岛素分泌量减少，导致血糖升高。

在验证了包含miR-122的外泌体通过靶向PKM来降低胰岛细胞的糖酵解水平从而减少胰岛素分泌之后，那么这个现象和乳腺癌的发展有什么关系呢，所以接下来作者就研究了miR-122抑制胰岛素分泌和乳腺癌发展的关系。他在这部分用到了三种细胞，一种是普通的MDA-MB-231细胞，还有一种是敲降了Rab27a的MDA-MB-231细胞，敲降Rab27a会抑制细胞分泌外泌体，另外一种细胞是敲除了miR-122的MDA-MB-231细胞。作者发现这三种处理在短时间内基本不会对细胞本身的生存情况造成影响。

作者通过动物实验发现，荷MDA-MB-231细胞组小鼠血液中miR-122含量增加，胰岛中miR-122含量增加，PKM表达量降低，血液中胰岛素及C肽含量降低，GSIS及葡萄糖耐受能力较差，小鼠体重、胰高血糖素及饥饿素含量无显著变化。

荷MDA-MB-231细胞组小鼠的肝脏组织中胰岛素信号通路被抑制，肝糖原含量下降，丙酮酸耐受能力减弱。

MDA-MB-231/Rab27aKD及MDA-MB-231/miR-122 KO组肿瘤生长速度减慢，Ki67阳性率降低。说面包含miR-122的外泌体通过抑制胰岛素信号通路，对于乳腺癌的生长有促进作用。

对MDA-MB-231/Rab27a KD的荷瘤小鼠注射野生型MDA-MB-231细胞的外泌体能够回复EV miR-122对于胰岛素信号通路的调节作用。

之后作者又用PDX模型产生的外泌体对于这一结论进行了验证。

PDX/control组的肿瘤生长速度较快，PDX/Rab27a KD及PDX/miR-122 KO组的肿瘤生长速度减慢，PDX/miR-122 OE组并没有进一步加快肿瘤的生长速度，说明miR-122对于肿瘤生长的促进作用可能已经达到了饱和水平。

这部分作者就在小鼠荷瘤模型及PDX模型中验证了乳腺癌来源的 miR-122 EV 会抑制胰岛素分泌，导致血糖升高，肿瘤生长速度加快。

接下来作者想验证一下主要是外泌体中的miR-122而不是其它成分在发挥作用。他们发现MDA-MB-231/miR-122KO组荷瘤小鼠肿瘤生长速度较慢，注射野生型MDA-MB-231来源的外泌体后，PKM被抑制，血液中胰岛素含量下降，胰岛素信号通路被抑制，葡萄糖耐受能力减弱，肿瘤生长速度加快。

之后他们又运用了miR-122的寡核苷酸抑制剂对这一结论进行了验证，就是miR-122主要通过外泌体的方式来影响机体代谢环境从而调控肿瘤的生长。

随后作者对于PKM在这一过程中的作用进行了探索。他们利用腺相关病毒8 (AAV8) 表达PKM2或EGFP (对照)，来恢复PKM2在β-细胞中的表达。

病毒通过胆管注射到达小鼠的胰腺部位。荷瘤5周后，AAV8-PKM2处理组小鼠胰岛PKM2表达水平以及血清中胰岛素含量和正常小鼠组相近。

PKM2回补处理组小鼠对于葡萄糖的耐受能力增强，EV miR-122所引起的一些列胰岛素信号通路的抑制作用被回复，肿瘤生长速度减缓。

在阐明了miR-122和PKM2对于胰岛素以及血糖水平能产生影响，从而影响肿瘤生长之后，作者又想去探究一下胰岛素浓度和血糖浓度是否真的能直接对肿瘤生长产生影响。作者首先在体外细胞实验中进行了探索，发现葡萄糖以剂量依赖式的方式促进肿瘤细胞的生长和增殖，而对正常细胞的生长无显著影响。

生理状态下的胰岛素浓度(5 mU/L, 7.5 mU/L)对于肿瘤细胞的生长增殖无显著影响，只有在超生理状态下的胰岛素浓度(500 mU/L)才对于肿瘤细胞的生长增殖有显著的促进作用。

而当作者采取体内缓释的胰岛素片剂对荷瘤小鼠进行胰岛素补充之后发现，补充胰岛素减弱了无瘤小鼠和荷瘤小鼠在基础胰岛素水平和葡萄糖刺激胰岛素水平、肝脏胰岛素信号通路强度和葡萄糖耐受能力方面的差异。胰岛素补充减缓了MDA-MB-231/control荷瘤小鼠肿瘤的生长速度。

而当作者采用体内抑制葡萄糖转运的抑制剂之后，发现荷瘤小鼠血糖水平降低，MDA-MB-231/control荷瘤小鼠的肿瘤生长速度减慢。

最后作者将他们的研究和临床相联系，发现乳腺癌患者中也存在血糖升高、C肽含量下降，β胰岛细胞的功能被抑制，血液循环中miR-122的含量升高的现象。