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亮点:
1、发现了使用EZH1/2抑制剂长期治疗导致耐药的机制；
2、提供了针对表观遗传学进行癌症治疗的新方法。
日本东京大学前沿科学研究生院计算生物学与医学系山岸诚（Makoto Yamagishi）博士和内丸薫（Kaoru Uchimaru）博士等团队联合，在国际知名期刊Nature发表了题为“Mechanisms of action and resistance in histone methylation-targeted therapy”的文章。表观基因组能够纠正癌症基因表达的紊乱，从而为药物干预提供新的靶点。本文中展示了EZH1-EZH2双重抑制剂Valemtostat（伐美妥司他）在成人T细胞白血病/淋巴瘤患者的临床试验中的效力、作用机制和耐药性。靶向表观遗传驱动因素和染色质动态平衡可能为进一步持续的表观遗传癌症治疗提供机会。
1、EZH1/2抑制剂伐美妥司他的临床益处
作者对参加伐美妥司他临床试验的患者进行了生存分析。在所有病例中，都在外周血中检测到病变，使其能够收集和分析外周血单个核细胞(PBMC)，以使用较少侵入性测试直接评估临床疗效和肿瘤特征。作者还应用整合到肿瘤基因组中的HTLV-1前病毒来提高肿瘤细胞鉴定的准确性。结果发现，在治疗1周后，异常淋巴细胞的数量急剧减少。同时，可溶性IL-2受体-α(sIL-2Rα)和HTLV-1感染细胞数量显著减少。所有患者都能在单一药物伐美妥司他上停留2年以上，安全性和耐受性均可接受。
作者在验证队列中观察到快速反应并在临床上诊断为部分或完全反应。靶向深度测序显示，主要克隆的变异等位基因频率降低，同时异常淋巴细胞和前病毒负载动态减少。作者进一步使用HTLV-1前病毒频率来量化多个克隆的大小。主要克隆和未展开的亚克隆被具有类似动态的伐美妥司他显著耗尽。
作者使用基于流式细胞术来分析量化ATL细胞中的H3K27me3甲基化变化。在前样本中，观察到的肿瘤H3K27me3水平普遍较高，但经伐美妥司他治疗后，其水平降至正常水平。在受试患者中观察到H3K27me3水平迅速下降，并观察到H3K27me3缺失与临床益处之间的统计相关性。
接下来，作者进行了染色质免疫沉淀测序(CHIP-seq)，以进一步评估伐美妥司他如何影响肿瘤表观基因组。与正常T细胞相比，预处理肿瘤细胞在H3K27me3中显示出总体增加趋势。H3K27ac与H3K27me3呈负相关。
伐美妥司他治疗显著降低了肿瘤抑制基因（TSG）中的H3K27me3水平，在所有病例中全基因组内均显示出H3K27me3峰的减少。在H3K27me3水平降低的区域，H3K27ac水平增加。EZH1和EZH2靶点都得到了类似的缓解。这一结果得到了肿瘤特异性批量RNA测序（bulk RNA-seq）证实。这些结果表明，伐美妥司他充分恢复了肿瘤细胞的表观基因组，使其接近健康状态，从而导致临床改善。
图1. 伐美妥司他的抗肿瘤作用
2、伐美妥司他使染色质重编程
作者进行了转座酶可及染色质的单细胞测序(scATAC-seq)，以评估伐美妥司他对染色质结构和基因调控的影响。作者收集了临床前、临床缓解(部分缓解或完全缓解)和疾病进展时的活PBMC样本，并对85,480个细胞进行了测序。
与正常的CD4+T细胞相比，治疗前扩散的肿瘤细胞在所有病例的整个基因组区域都显示出聚集的染色质结构。同一病例的CHIP-seq数据相比，ATAC峰与H3K27me3水平呈负相关。H3K27me3标记累积在与肿瘤相关的浓缩染色质区域。所有病例经伐美妥司他治疗后，凝固区均缩小。
伐美妥司他对H3K27me3水平的降低与染色质松弛有关，在所有情况下都将失活基因的数量减少到正常细胞的水平。失活基因包括几个与T细胞功能和免疫反应相关的基因。为了进一步研究染色质结构变化对基因表达的意义，作者对所有PBMC样本进行了scRNA-seq分析。结合相应的scATAC-seq数据，基因表达与启动子活性呈正相关。综合数据表明，伐美妥司他松弛了染色质结构，并在H3K27me3积累的位置诱导了表达。
具有代表性的H3K27me3靶基因(miR-31、BCL2L11等)的染色质可及性被伐美妥司他增加。治疗前ATL细胞中共有246个基因普遍上调，其中包括与细胞生长和凋亡调控相关的基因。作者对109,830个细胞进行了测序，并获得了相同单个细胞的ATAC和基因表达数据，证明了染色质结构的改变是肿瘤发生过程中基因表达的主要原因。
作者确定了肿瘤发生的关键基因，这些基因因染色质结构的聚集而沉默。整合相应的芯片序列数据，进一步支持肿瘤特异性沉默区域积累了H3K27me3标记。H3K27me3水平的降低是由伐美妥司他诱导的，从而疏松了染色质结构并诱导了基因表达。以上结果直接表明接受伐美妥司他治疗的患者中异常的H3K27me3标记被消除，染色质聚集和基因沉默被释放。
图2. 伐美妥司他使染色质解解聚
3、获得性PRC2突变的耐药性
作者研究了复发是如何发生的，使ATL细胞找到了对抗表观遗传疗法的适合性。首先在PT1进展性疾病的克隆群体中发现了EZH2的Y111氨基酸残基上的一个特征性体细胞突变。在10例中，有5例在伐美妥司他结合口袋周围的多梳抑制复合体(PRC2)基因复合体的核心成分中检测到体细胞突变。所有这些突变都出现在治疗前存在的原始克隆的种群中。
作者进一步研究了PRC2界面突变对H3K27me3的影响。在表达EZH2或EED突变体的293T细胞中，细胞H3K27me3水平保持在未处理的水平，即使在缬列他司的存在下也是如此。此外，作者建立了一种稳定表达PRC2突变体的ATL细胞系，并在伐美妥司他存在下进行了抗性生长测定。发现PRC2突变导致了耐受细胞的出现。这些出现的细胞对伐美妥司他引起的表观遗传学反应不太敏感，因此对靶TSG的再激活不太敏感。
对携带EZH2Y111S和EZH2Y661N的进行性疾病临床克隆中H3K27me3水平的直接评估进一步证实了处于高甲基化状态的肿瘤细胞正在重新繁殖。在临床反应期间检测到的H3K27me3低细胞几乎消失。此外，H ChIP–seq显示，这些具有抗性突变的重新填充细胞恢复了治疗前检测到的类似模式，表明H3K27me3的恢复导致临床复发。
scATAC-seq时间序列数据显示，在治疗前失活的启动子被伐美妥司他显著地重新激活。突变发生后，在快速繁殖的抗性克隆中，同一基因集发生了强烈的染色质压缩，表现出明显的恢复到原始染色质结构的趋势。此外，scRNA-seq分析证实了突变体EZH在进行性疾病克隆中的表达。在这个进行性疾病克隆中，治疗前表观遗传失活基因的表达也被强烈沉默，这与scATAC-seq数据很好地对应。
这些证据共同表明，克隆选择的PRC2基因突变导致了耐药性的产生，通过染色质再聚合几乎完全逆转了伐美妥司他的影响。
图3. 伐美妥司他的耐药机制
4、DNA甲基化导致的表观遗传动态平衡
作者注意到，即使H3K27me3的肿瘤水平保持在较低水平，一些患者仍表现出复发。在这些情况下，其他患者的复发克隆的全基因组测序和深度测序显示PRC2基因没有获得性突变。所以作者专注于表观基因组相关基因，在PT3中选择的进行性disease克隆中检测到TET2基因的功能缺失。TET2突变在AT L中很少发现，在治疗前也没有检测到，这表明该突变是在治疗诱导的选择过程中获得的。
在PT2中，尽管没有检测到表观基因组相关基因突变，但scRNA-seq分析确定了DNMT3A表达。scATAC-seq数据显示，DNMT3A基因座的增强子在复发克隆中被激活并表观遗传学进化。作者从scATAC-seq解释了这些表观遗传因子的进化影响，发现没有PRC2突变的重复克隆也表现出染色质重新聚集。相反，在复发后观察到的获得性拷贝数减少更常见于活跃的基因位点，与基因失活无关。
考虑到在DNA甲基化途径中检测到异常，作者研究了复发性染色质再缩合与DNA甲基化的关系。没有PRC2突变的进展性疾病细胞显示TSS附近的DNA甲基化增加，在那里H3K27me3被浓缩。
作者对每个样本平均2830万个CpG位点的全基因组DNA甲基化状态进行了描述，并在H3K27me3最初积累的伐美妥司他目标区域检测到了进行性疾病相关的mCpG获取克隆。作者还发现H3K27me3相关染色质缩合为特征的基因可被伐美妥司他恢复，但在进展性疾病时再次被mCpG增益强烈重缩。
因此，由伐美妥司他恢复的几个重要的TSG的基因调控再次被局部补偿mCpG获取。作者建立了一个PT2衍生的进行性疾病细胞系。相关实验结果表明，该细胞系具有相同的克隆来源，不存在突变，表现出高表达DNMT3A和对伐美妥司他的低敏感性。细胞生长被DNMT3A靶向的shRNA抑制，表明细胞变得依赖DNMT3A而不是PRC2。
图4. 伐美妥司他耐药的非遗传机制
5、获得性耐药性中的DNMT3A和TET2
作者通过长期接触伐美妥司他建立了两个耐药的ATL细胞系。耐药细胞优先表达功能丧失的TET2的 mRNA，相反，TET2基因转移增加了对valemtostat的敏感性，表明克隆依赖于TET2。
TET2基因敲除的细胞显示出显著的抗性生长能力，在伐美妥司他存在下出现了大量的抗性克隆细胞。出现的生长克隆显示TET2表达降低，H3K27me3表达水平较低。有趣的是，这些细胞对低剂量的DNA甲基化抑制剂地西他滨很敏感。
作者还通过长期暴露于伐美妥司他开发了另一个耐药细胞系，其DNMT3A表达增加和CpG高甲基化。该耐药细胞模型对PRC2基因敲除和伐美妥司他处理的敏感性较低，并通过针对DNMT3A的shRNA实验恢复了敏感性。耐药相关的DNA甲基化被DNMT3A靶向shRNA取消。此外，强制表达DNMT3A本身在不同的淋巴瘤模型中引起强劲的耐药生长。
这些结果表明，DNMT3A导致了一种表观遗传获得抗性。综上所述，作者得出结论，尽管使用了不同的基因，但基于共同染色质结构的机制获得了抗性。
6、具有不同易感性的亚群
在抗性细胞中检测到的所有异常都是在持续的治疗相关压力下几个月后选择的可遗传特征。这种可遗传克隆的缓慢出现表明存在由易感性差异引起的初级耐受性。对scRNA-seq数据重新聚类，产生了两个具有相互不同表达模式的亚聚类。这两个簇在调节性T谱系标记基因的表达上没有显著差异，这是ATL细胞的特征。H3K27me3靶基因在SC-B簇中的表达略低于在SC-A中的表达，并且这一特征一直保持到疾病进展。
为了表征将SC-B和SC-A区分为进行性疾病克隆的可能来源的分子特征，作者进行了基因集富集分析。在SC-B中观察到与代谢相关的基因的显著富集。SC-B中的氧化磷酸化基因和线粒体相关基因的基因表达水平更高。这些特征一直保持到复发阶段。此外，核糖体蛋白基因的表达在这两个簇之间存在显著差异。
为了表征转录特征，作者分析了来自另一个队列的scRNA-seq数据。结果显示，在其他病例中观察到这些亚群，表明存在这种异质性。此外，H3K27me3高ATL细胞的RNA免疫沉淀（RIP）显示，PRC2因子的mRNA被eIF3D选择性捕获的量与JUN mRNA一样多或更多，JUN mRNA是eIF3D30,31的已知靶标。
为了直接检查在scRNA-seq中鉴定的肿瘤细胞亚群如何与对缬依司他的反应性有关，在给药后但在获得EZH2突变之前，从两个样本中分选出H3K27me3水平耗尽或相对较高的细胞。结果表明，低敏感细胞群体具有高蛋白水平的线粒体因子，以及eIF3及其靶标，如PRC2因子和JUN。
为了检测5′UTR的作用，作者建立了EZH2 5′UTR缺失模型。该细胞模型的RIP显示EZH2 mRNA选择性地减少了eIF3D复合物的掺入，并降低了多聚体的形成和翻译效率。EZH2和H3K27me3水平降低。该模型也表现出增殖能力下降和对低浓度伐美妥司他的早期反应，从而表明增强的eIF3活性和EZH2的5′UTR与敏感性有关。这些结果支持了亚群中的转录差异与伐美妥司他敏感性有关的观点。
图5. 具有不同易感性的固有亚群
这项研究说明了患者对组蛋白甲基转移酶抑制剂的反应的分子和细胞动力学。多层组学分析和临床资源的整合表明，消除H3K27me3会导致癌症表观基因组的重新编程，从而发挥持续的临床效益。此外，未接受治疗的患者和适应治疗的患者都表现出典型的浓缩染色质结构，这表明染色质致密对于肿瘤的维持和生长是不可或缺的。这项研究中提出的表观遗传疗法可以为持久的癌症治疗提供一条新的途径，提供巨大的机会。
作者介绍
山岸诚博士
山岸诚博士是东京大学前沿科学研究生院计算生物学与医学系肿瘤学与基因组学实验室准教授、医学基因组学专业博士。山岸诚教授长期从事肿瘤生命科学相关研究，包括：1、病毒致肿瘤机制的研究；2、关于癌症和感染症的表基因组编码的研究；3、关于癌症和感染症克隆进化的研究；4、运用数据科学的新治疗药开发研究。
内丸薫（Kaoru Uchimaru）博士
东京大学大学院新领域创成科学研究科医学信息生命专业病态医疗科学领域教授。以1型人类T细胞白血病病毒（HTLV-1）和由此发病的成人T细胞白血病·淋巴瘤（ATL）以及HTLV-1相关脊髓病（HTLV-1 Associated Myelopathy:HAM）为研究对象，融合基因组科学、生物信息学、多基因分析等各种尖端生物学信息技术开展相关疾病发生发展机制的基础研究。
铃木登（Yutaka Suzuki）
东京大学大学院新领域创成科学研究科医学信息生命专业/系统医学讲座/基因组控制医学领域教授。铃木登教授的研究小组到去年为止，以完全长cDNA文库为基础，创造了覆盖约3万种人类基因大部分的完全长cDNA数据。另外，建立了数据库DBTSS（http://dbtss.hgc.jp）并公开。目前，铃木登教授通过多种方法在分子生物学和信息学上进行了综合分析，以便从不断积累的转录组的资源和启动子的序列信息中引出关于转录控制网络的整体图像的生物学见解。
参考文献
Makoto Yamagishi, Yuta Kuze, Kaoru Uchimaru et al. Mechanisms of action and resistance in histone methylation-targeted therapy.Nature. 2023; https://doi.org/10.1038/s41586-024-07103-x
