Redox氧化还原修饰｜全面解析氧化还原修饰蛋白质组的研究热点

活性氧（ROS）会在半胱氨酸残基和蛋白质骨架内产生各种可逆的修饰。这些氧化翻译后修饰（PTM）可以参与信号转导途径的激活并调节细胞功能。不仅有大量研究表明蛋白质的氧化修饰与癌症，糖尿病，神经退行性疾病和一些罕见的遗传性代谢疾病（如经典半乳糖血症）发展的病理机制有关，而且还在植物生长发育、新陈代谢等的调控中扮演着重要角色，使植物能够适应不断变化的环境限制。接下来就来一起深入的了解一下这些半胱氨酸氧化还原修饰吧！

作为氧化还原信号转导过程与小分子作用的一个重要主体，巯基是蛋白质残基中最具反应性的基团，在反应活性氧的作用下，可以发生可逆的氧化反应，如二硫键(S-S)形成、S-谷胱甘肽化（SSG）、S-亚硝基化（SNO）、S-次磺酸化（SOH）等，这几种半胱氨酸氧化修饰可以被相应的还原剂还原成游离巯基（-SH）。这些氧化还原修饰可以调节蛋白质的构象和功能，进而影响细胞生理过程和细胞稳态。

图1 氧化还原修饰类型

（图源：Lennicke C, et al., Biochem Soc Trans, 2020）

图2 氧化水平影响体内半胱氨酸的氧化还原状态，并导致不同的细胞反应

（图源：Lennicke C, et al., Mol Cell, 2021）

氧化还原PTM调控蛋白质的功能，这些蛋白质参与能量代谢、蛋白质折叠和降解以及基因转录等重要途径。在年轻的健康细胞中，氧化还原PTM是正常细胞信号的组成部分，可以根据局部活性氧和活性氮（RONS）的组成和水平调节多种蛋白质的活性。在衰老过程中，RONS的产生和细胞的抗氧化能力之间的失衡导致O/N应激，蛋白质可能会发生异常修饰。这些氧化还原PTM可以影响目标蛋白的功能，最终改变导致衰老的关键途径。此外，有研究发现，半胱氨酸和其他残基上蛋白质氧化还原PTM的异常可能与衰老过程中观察到的能量代谢受损、突触传递减少等的原因。

图3 氧化还原PTM对衰老的影响

（图源：Finelli MJ. Front Aging Neurosci, 2020）

在与年龄有关的神经退行性疾病中，往往伴随着O/N应激和氧化还原PTM增加。氧化还原PTM不仅可以促进疾病相关蛋白的聚集，还会损害靶蛋白的功能，导致许多重要途径比如线粒体功能、蛋白质平衡、神经炎症等失调，从而加速疾病进程。

此外，在神经退行性疾病中持续观察到在细胞生理学中起关键作用的蛋白质的异常氧化还原PTM。例如，氧化还原敏感的动力蛋白相关蛋白1（Drp1）是一种参与线粒体裂变的GTP酶，发生S-亚硝化后在阿尔茨海默病的线粒体动态缺陷和神经变性中起着关键作用。多功能蛋白PDI作为一种氧化还原酶伴侣，PDI的异常S-亚硝化使其伴侣和异构酶活性失活，这导致错误折叠蛋白的积累和持久的内质网应激，最终触发神经元损伤和死亡。

图4 氧化还原PTM对神经退行性疾病的影响

（图源：Finelli MJ., Front Aging Neurosci, 2020）

鉴于O/N应激和相关修饰在许多疾病的发作和进展中的重要性，氧化还原PTM，特别是不可逆氧化还原PTM，已被提出作为包括心血管和肺部疾病在内的一系列疾病的潜在循环生物标志物。氧化还原PTM可以影响靶蛋白的构象及其与其他蛋白质和潜在药物的结合亲和力，靶向特定蛋白质的氧化还原PTM，以调节蛋白质功能并抵消神经退行性过程，在疾病治疗方面具有巨大的潜力。例如一种新的药物NitroSynapsin，它可以抑制NMDAR（对神经传递，学习和记忆形成至关重要）的过度活跃，同时通过结合在过度开放的通道内，并作为一个NO基团供体，通过其氧化还原敏感的Cys残基的S-亚硝基化来触发NMDAR失活，从而保留其生理功能，可明显改善与AD相关的病理特征。

图5 氧化还原PTM的治疗潜力

（图源：Finelli MJ., Front Aging Neurosci, 2020）

越来越多的证据表明，蛋白质中半胱氨酸残基的氧化还原修饰参与多种细胞死亡模式的调节，可以通过调控细胞收缩、DNA断裂、膜破裂、炎症反应等调节细胞凋亡、坏死性凋亡和焦亡。此外，最近的研究表明，硫醇氧化还原开关在调节细胞凋亡和坏死形式之间的串扰中发挥作用。

图6 氧化还原PTM调节细胞凋亡、坏死和焦死途径

（图源：Benhar M., Antioxidants (Basel), 2020）

半胱氨酸的可逆氧化还原在新陈代谢、生长和发育的调控机制中发挥重要作用，使植物能够适应不断变化的环境限制。鉴定活性半胱氨酸残基不仅对于了解蛋白质的功能至关重要，而且还可以深入了解植物对环境变化的反应机制。

2019年，Javier Pozueta‐Romero团队发现质体硫醇氧还蛋白还原酶C（NTRC）通过影响光合作用的氧化还原修饰蛋白质组变化，来作为植物响应微生物挥发性物质（VC）的重要介质。

图7 植物对微生物挥发性化合物(VCs)反应的模型

（图源：Ameztoy K, et al., Plant Cell Environ, 2019）

ROS是细胞代谢不可避免的产物，细胞内高水平的ROS直接或间接的参与细胞信号传导，诱导细胞凋亡，是糖尿病、动脉粥样硬化和癌症等许多疾病的共同发病机制。研究发现，氧化还原PTM可以改变激酶（如Akt，mTOR和AMPK）和磷酸酶的活性，在基于ROS、磷酸化的信号转导和一些生理过程之间提供联系。除了磷酸化，氧化还原修饰还可以与SUMO化、泛素化、乙酰化等发生crosstalk来调控信号网络。

2019年来自悉尼大学的David E. James教授团队利用磷酸化蛋白质组、半胱氨酸氧化还原修饰蛋白质组以及全蛋白质组，对氧化应激条件下全局信号网络进行了完整的分析。该研究揭示了氧化应激条件下脂肪细胞信号通路的变化以及半胱氨酸氧化和磷酸化信号之间的crosstalk。一些关键激酶包括Akt，mTOR和AMPK的氧化修饰对其信号通路的调控非常重要，为了解修饰crosstalk依赖的信号网络调控，及其在生理病理条件下的作用机制提供了新的依据与视角。

图8 氧化还原信号与磷酸化信号之间的crosstalk

（图源：Su Z, et al., Nat Commun, 2019）

氧化还原修饰状态往往受细胞内氧化水平的影响，根据细胞内的氧化程度，半胱氨酸发生不同的氧化修饰类型，并导致不同的细胞反应：1）主要的半胱氨酸氧化修饰（如次磺酸化）发生在非应激情况下，对细胞生存和增殖至关重要；2）氧化程度增加则会导致半胱氨酸的适应性反应，以及亚硝基化和谷胱甘肽化；3）严重的氧化应激会导致衰老或细胞死亡，并伴随着过度氧化的半胱氨酸氧化形式，如亚磺酸化和磺酸化；4）缺氧和还原应激状态下会破坏基本的氧化还原反应，并可能导致细胞死亡。

图9 氧化水平影响体内半胱氨酸的氧化还原状态，并导致不同的细胞反应

（图源：Held JM, et al., Mol Cell Proteomics, 2012）

尽管氧化还原修饰已经研究了几十年，但是由于半胱氨酸巯基氧化修饰的复杂性，比如同一位点具有不同的修饰类型，不同位点具有不同的修饰类型，不同位点具有相同的修饰类型，以及氧化还原PTM的不稳定性质和相对较低的丰度，对于氧化还原修饰蛋白质组的研究仍具有很大挑战性。基于质谱的氧化还原修饰蛋白质组学方法是研究蛋白质氧化还原修饰的方法之一，该方法可大规模地定性、定量半胱氨酸氧化修饰的蛋白质及其位点，观察整体氧化修饰水平变化以及特定修饰位点比例变化，以研究不同的氧化水平在生物学过程中的调节作用。

图10 蛋白分子亚型（Dynamic PTMs）

通常差异倍数（fold change）不能提供氧化还原调控的全貌，因为不同占比的氧化修饰，在氧化应激下会得到相同的差异倍数。如下图所示，分别具有低(1%)、中(10%)和高(50%)比例的氧化修饰程度在氧化应激下都显示相同的两倍变化，而随着氧化修饰的程度增加对于PTM调控的功能影响也将显著改变。因此，如果将重点放在差异倍数的分析上，关键生物学相关位点的识别可能会被忽略。

由于蛋白质氧化还原PTM引起的生物效应，氧化修饰比例的显著变化可以在不改变蛋白质丰度的情况下引起蛋白质活性的巨大变化，根据修饰的类型和蛋白质的不同，半胱氨酸氧化还原修饰可以激活或失活蛋白质的功能。例如右图显示了氧化修饰比例的变化与激活蛋白质的关系，其中氧化越多，活性蛋白质越少。某些蛋白质的氧化还原修饰位点比例可能会随着疾病或生理状态的变化而改变。因此，分析特定修饰位点比例有助于解释修饰的功能相关性，以区分具有生物意义的位点，有助于研究人员更好地理解氧化还原控制的蛋白质巯基网络。

图11 氧化还原PTM的位点比例

（图片再编辑，源自：Zhang T, et al., Am J Physiol Cell Physiol, 2021;

Day NJ, et al., Antioxidants (Basel), 2021）

total氧化还原修饰蛋白质组是对生物样品中的total氧化还原修饰位点/肽段进行全局无偏的定性定量分析，用于探究上述领域的生物学机制和靶标发现。以下是我公司该产品的特点：

在蛋白质氧化还原检测分析方法中，最为广泛使用的是生物素交换法。首先将氧化修饰位点还原为自由巯基，进而使用生物素将其标记，被标记地半胱氨酸残基可进一步通过质谱方法进行检测分析。

拜谱生物total氧化还原PTM平台拥有丰富的服务经验，目前承接过的样品类型有香蕉果皮、牛肌肉、鼠乳腺组织、羊组织、人源细胞和小鼠肝脏组织等。

基于质谱的半胱氨酸氧化还原修饰蛋白质组学能够识别氧化还原敏感的Cys位点及其修饰，还可以分析特定修饰位点占total氧化还原修饰位点的比例，特定修饰位点占总巯基的比例，以及total氧化还原修饰位点占总巯基的比例，以区分具有生物学意义的位点，有助于研究人员更好地理解氧化还原控制的蛋白质巯基网络。

氧化还原修饰可以通过与磷酸化、乙酰化、SUMO化、泛素化等发生crosstalk来调控信号网络，在信号转导和一些生理过程之间提供联系。拜谱生物可对多种修饰间的crosstalk进行深度分析，助力调控机制等研究。

蛋白质中的半胱氨酸是一个极其活跃的残基，可以进行多种翻译后修饰，除total氧化还原修饰蛋白组检测以外，我们还可提供棕榈酰化、谷胱甘肽化以及亚硝基化修饰蛋白组分析，以及次磺酸化和巯基化正在开发测试中。