黄灿华教授 实验室

2021.12.25 石佳艳分享“相分离在肠道和肝脏中激活NLRP6炎症小体”的故事




大家好,今天给大家分享的这篇文章是202111月发表在cell上的论文: Phase separation drives RNA virus-induced activation of the NLRP6 inflammasome.



本篇文章的通讯作者分别是哈佛大学医学院的吴皓教授和中国科学技术大学生命科学学院的朱书教授。吴皓教授也是美国国家科学院院士,其实验室的主要研究方向包括免疫相关蛋白的结构和功能。朱书教授团队的主要研究方向为肠道免疫的相关机制。

在分享本篇文章之前,我想先给大家介绍一些相关的背景知识:



炎症小体,是一种蛋白复合体,主要由识别分子,接头分子,效应分子三部分组成。其中识别分子包括:NOD样受体家族分子(NLR),如NLRP3;AIM2样受体家族分子(ALR),如AIM2。接头分子是指接头蛋白ASC,即包含CARD结构域的凋亡相关点状蛋白效应分子主要是发挥相关功能的caspase蛋白,如caspase-1

由于识别分子的多样性,所以炎症小体也有很多种。以左边图中的NLRP3炎症小体为例,我们一起来看一下炎症小体的结构。接头蛋白ASC包含PYD结构域和能够招募caspase的结构域CARD,这样它就能起到一个类似桥梁的作用,连接识别分子和效应分子。激活的NLRP3通过PYD之间的相互作用与ASC相结合,而caspase-1通过CARD的相互作用与ASC结合,从而组装形成NLRP3炎症小体。



炎症小体是固有免疫系统中的重要部分,它可以响应外源性病原体或内源性危险信号,从而引发炎症反应。如图所示,炎症小体NLRP3的活化会促进caspase-1的激活,被激活的caspase-1可切割并激活相关促炎细胞因子,如IL-1β和IL-18,最终导致炎症反应的发生。



本篇论文发现了双链RNA可以在体外以及细胞内诱导NLRP6发生液液相分离从而激活炎症小体,其中NLRP6内一段富含赖氨酸的区域对于相分离的发生和其多价相互作用十分重要。另外,接头蛋白ASC可以固化NLRP6的相分离作用。并且作者在肠道和肝脏中都分别验证了NLRP6的相分离作用及其促进炎症小体的激活。

介绍到这里,大家对本篇文章的研究内容应该有了一个初步的了解。接下来,我们来详细的看一下这篇文章的具体实验内容。



首先,作者想弄清NLRP6的直接配体有哪些。在2015年,王鹏华和朱书等人发现NLRP6在空肠中介导识别脑心肌炎病毒和诺如病毒的重要作用(这篇文章也发现了NLRP6 可以和长dsRNA类似物Poly I:C 结合)。2017年,朱书等人发现NLRP6具有直接结合双链RNA(dsRNA)的能力。值得一提的是,当时这两篇论文的作者之一朱书,也就是本篇论文的通讯作者之一。

于是本文的作者也顺着这个思路,首先验证了NLRP6与长双链RNA类似物Poly I:C以及20bp短双链RNA之间的直接结合。微热量泳动实验也证明了这一点,NLRP6双链RNA之间的结合能力最强,而不与其它形式的核酸有直接的相互作用,或作用力极弱。同时,作者也对之前有文献报道的可能的其他配体进行了检验,发现除了双链RNA之外,NLRP6还能与LTA(脂磷壁酸)直接结合。



而且较长的dsRNA相较于较短的dsRNA,表现出与NLRP6之间更强的亲和力。



NLRP6的主要结构域包括了3部分:N端可与接头分子相互作用的PYD中间包含了NBD(核苷酸结合域)的NACHTC端富含亮氨酸重复区域LRR。作者根据这些结构域构建了相应的重组蛋白,并对其与dsRNA之间的亲和力进行分析。结果发现介导NLRP6与dsRNA发生相互作用的主要是NACHT-LRR结构域,而PYD结构域似乎不怎么发挥作用。



除了NLRP6以外,还有其他的NLR蛋白,如NLRP3和NLRC4,但是只有NLRP6能与dsRNA结合,而NLRP3和NLRC4似乎不能。这说明,NLRP6具有特异性识别来自各种病原体双链RNA的潜力。

在确认了NLRP6能与dsRNA发生直接结合后,作者想知道dsRNA对于NLRP6能起到一个什么样的作用呢?



作者发现NLRP6溶液与各种RNA混合后,溶液变得浑浊了,于是猜测发生了相分离作用,接下来便进行了相应的验证。

作者首先表达纯化了带有mCherry标签的NLRP6的蛋白,并将其与荧光素亚酰胺(FAM)标记的dsRNA混合。45分钟后,通过荧光显微镜观察到NLRP6-mCherry和dsRNA共定位并可以以时间依赖性方式成液滴。而且该液滴相互之间可以融合,证明了其动态性良好。



接下来,作者对完整液滴以及液滴的局部区域都进行了光漂白恢复实验。两种光漂白都在120s内得到了较好的恢复,这表明了液滴与周围物质的快速交换,进一步证明了其动态性。

通过统计所有液滴的面积和,对诱导相分离发生所需要的NLRP6以及dsRNA的浓度进行探究发现,相分离的发生具有NLRP6和dsRNA的浓度依赖性。使用浊度测定法测量395nm处的OD值,也证明了相分离的发生具有NLRP6和dsRNA的浓度依赖性。其中NLRP6的浓度似乎对相分离的影响更大,虽然低浓度的NLRP6发生相分离需要dsRNA的诱导,但是高蛋白浓度下的NLRP6可以自行形成液滴。



作者想进一步探究NLRP6是否能在细胞内发生相分离。为此构建了一个能够稳定表达鼠源带GFP标签的NLRP6的小鼠胚胎成纤维细胞株。在转染了Cy5标记的dsRNA后,作者在细胞内观察到与dsRNA共定位NLRP6斑点的形成。通过活细胞追踪成像发现,NLRP6dsRNA共定位斑点dsRNA转染后不到一小时内出现。首先出现的是单独的dsRNA斑点。



蛋白的内在无序区域(IDR)通常可以驱动相分离的发生。作者利用相分离在线预测工具(PONDR),预测出6个人源和鼠源NLPR6中皆高度无序的区域



为了确定预测的IDR是否可以在细胞内诱导相分离的发生,作者通过光控实验发现只有NLRP6(97-188)和NLRP6(284-354)这两段预测的IDR可以促进相分离的发生。



在对这两段IDR,即 NLRP6(97-188)和NLRP6(284-354),序列比较时发现:高频的碱性氨基酸区域在不同的物种间也具有保守性。这提示这两段富含碱性氨基酸的区域可能有特别的功能。于是作者分别将这两段序列中的赖氨酸和精氨酸突变为丙氨酸,并构建相应的细胞系。

在细胞内转染dsRNA后发现,K350-354A突变显著减少了dsRNA诱导的NLRP6相分离。人源NLRP6中对应的K352-356A突变也可以在体外减少NLRP6液滴的形成。




然而K350-354A突变没有明显削弱NLRP6与病毒RNA结合的能力。K350-354A突变却减弱了GSDMD和Pro-Caspase-1的剪切,另外乳酸脱氢酶(LDH)释放实验也表现出类似的结果。即K350-354A突变由于其导致NLRP6相分离能力的不足而减弱了对炎症小体的激活作用。



接下来作者想进一步在小鼠体内探究NLRP6相分离的作用。为了检查内源性NLRP6主要在什么组织中表达,作者首先构建了Flag-Nlrp6敲入的小鼠品系,发现内源性Flag-Nlrp6在肠上皮细胞(IEC)和肝细胞(Hepatocyte)中高表达。同时通过RT-qPCR实验发现Nlrp9b在肠上皮细胞(IEC)中高表达Nlrp3在 kupffer细胞和骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)中高表达。这表明NLRP6可能在肝细胞中具有特别的作用,于是作者构建了小鼠肝炎病毒(MHV)感染肝脏的病毒感染模型。



在MHV感染以后,与非感染对照组和Nlrp6-/-组相比, MHV感染的野生型小鼠肝脏切片中可观察到诱导的内源性NLRP6-dsRNA斑点和内源性NLRP6-ASC斑点。而病毒感染后,Nlrp6敲除小鼠的肝脏中观察不到NLRP6相分离的发生。



此外,病毒感染后Nlrp6敲除小鼠GSDMD的剪切和细胞死亡减少。当敲除NLRP6或其它炎症小体组分如ASC时,IL-18的分泌较野生型小鼠明显减少,且病毒复制率明显升高。说明MHV感染小鼠导致NLRP6炎症小体的激活,而敲除NLRP6会抑制NLRP6炎症小体的激活,导致病毒感染的增强。



为了验证体内NLRP6相分离对NLRP6炎症小体的激活的生理作用,作者构建了携带Nlrp6中K350-354A突变的基因鼠模型。基因鼠肝脏和小肠中NLRP6蛋白水平不受K350-354A突变影响,但NLRP6相分离发生受到了抑制此外,在MHV感染以后,K350-354A突变会减少IL-18的释放、GSDMD的剪切和细胞死亡。

以上证据充分表明,NLRP6及其发生相分离的能力在肝脏内激活炎症小体和抗MHV病毒感染中很重要。




作者还发现,相比于NLRP9b,NLRP6在远端小肠中的表达量低。于是作者又在十二指肠和近段小肠中对NLRP6及其发生相分离的能力进行了探究。





与肝脏中得到的结果类似,这些数据表明NLRP6发生的相分离和NLRP6炎症小体的激活在维持小鼠肠道稳态中具有重要性。

在之前的实验中探究了NLRP6相分离的发生及其对NLRP6炎症小体激活的影响,接下来作者还想探究一下其它炎症小体组分如ASC是否对NLRP6相分离有影响。



首先发现TAMRA标记的ASC PYDdsRNA-NLRP6液滴共定位。尽管这种液滴还保持圆形形态,荧光漂白恢复能力极弱,与单独的dsRNA-NLRP6液滴是不同的。



进一步的实验证明了NLRP6相分离不需要PYD-PYD相互作用,不需要ASC蛋白。



类似的,相关实验也在细胞内证明了ASC可固化NLRP6的相分离




值得注意的是,NLRP6存在于多种宿主的防御系统中,于是作者猜想NLRP6相分离的发生是否有利于其多功能性。

作者首先对脂磷壁酸LTA(先前体外实验中检测到与NLRP6结合的唯一其他配体)与NLRP6相分离发生之间的关系进行了探究。体外和细胞内的实验都证明,LTA可诱导NLRP6相分离的发生。此外DHX15和NLRP6共定位于dsRNA诱导的液滴中该过程也涉及NLRP6相分离的发生



这些实验结果表明NLRP6发生相分离作为一个整合信号通路的平台,解释了NLRP6介导和整合多种信号(RNA,LTA,inflammasome, interferon)的能力。



以上就是本研究的主要内容,在本篇文章中首次提供明确的证据,证明NLRP6炎症小体形成过程中发生了相分离作用,并且发现了其中一段富含赖氨酸的区域对于相分离发生和多价相互作用的重要性。此外,本篇文章还通过构建NLRP6K350-354A突变小鼠证明了体内相分离的发生在生理条件下的功能,具有创新性