黄灿华教授 实验室

2021.10.20 粟苗分享“ERα是一种维持肿瘤细胞存活和耐药性的RNA结合蛋白”的故事



大家好,今天给大家分享的这篇文章是加州大学旧金山分校Davide团队今年9月在cell上发表的论文: ERα是一种维持肿瘤细胞存活和耐药性的RNA结合蛋白

先来介绍一下文章的通讯作者加州大学旧金山分校泌尿外科教授Davide Ruggero,他们团队目前的研究旨在了解mRNA 翻译、细胞生长和整体蛋白质合成率受损导致人类疾病和癌症的分子机制。以下这是她近期的一些研究成果。




众所周知,雌激素受体α (ERα)是70%以上乳腺癌的关键驱动因素,然而,几十年来对ERα 的研究仍然主要集中在其结合DNA的活性上。Davide Ruggero的这篇论文研究发现

ERα 是一种对乳腺癌至关重要的转录因子,是一种 RNA 结合蛋白ERα调节应激反应基因的转录后表达ERα RNA 结合活性对于翻译控制和 XBP1 剪接很重要综合来说 ERα RNA 结合活性对肿瘤生长和治疗反应至关重要

ERα 是一种核质穿梭蛋白,在细胞核和细胞质之间快速易位为了解ERα是否以及如何在细胞核外发挥作用,首先进行ERα免疫沉淀然后进行定量质谱分析,以确定ERα + MCF7 乳腺癌细胞的细胞质部分中可能的ERα蛋白相互作用组。有趣的是,与ERα 相互作用的最丰富的蛋白质类别是结合RNA 的蛋白质(转录因子、核蛋白、mRNA调节蛋白、剪切蛋白、调节RNA稳定的蛋白)为了研究ERα是否具有RBP的功能,作者采用了低聚糖珠来下拉mRNAs,实验结果表明,在 Erα+的乳腺癌细胞系中,相当一部分的ERα能够与RNA相结合另外,在人乳腺肿瘤样本中也明显高于正常邻近组织为了能够进一步确认ERα能够直接结合RNA,作者使用CLIP技术,将免疫沉淀复合物电泳(RNA是P32标记的,可以放射自显影),用高浓度 RNase 消化未与蛋白结合的RNA,可以观察到清晰的Erα条带。这证明了 ERα 能够直接结合 RNA。



接下来为了寻找ERα的RNA结合靶点,作者对ERα CLIP文库进行的测序,结果显示ERα的结合位点位于RNA上的外显子和内含子区域,并且在转录本中的ERα优先在3UTR处相结合,通过生信分析发现,ERα 结合的mRNA与癌症进展至关重要的内质网应激反应,凋亡负调节等过程关联系很大。同时作者发现了一种含有丰富的ERα CLIP峰的序列基序这种基序在许多ERα结合的mRNA中被发现。ERα的RNA结合位点的保守性表明了其在RNA调控中可能发挥一定功能。最后,作者选择了CLIP测序中的第一个RNA分子XBP1来进行热稳定检测。结果显示:当ERα和XBP1一起孵育时,ERα的熔化温度以剂量依赖的方式显著提高。这些实验结果进一步证明了ERα可以与RNA直接结合能力。



作者接下来开始探究ERα与RNA相关联的具体结构域。利用RNABindRPlus来预测ERα的RNA结合域。预测结果显示:其中一个关键的RBD位点位于ERα铰链区域内的255-272位氨基酸之间体外构建不同截的ERα,并用 RNA pulldown去检测,发现只有包含预测RBD的ERα在体外与RNA直接作用并且当截短突变预测的这段RBD位点时,ERα和RNA的这种关联就消失了。这就证明了ERα通过255-272位氨基酸之间的RBD与RNA进行结合。



接下来作者构建了ERα的RBD突变体,并且加上Flag蛋白标记,构成了稳定的ERα RNA结合能力缺陷型的MCF7和T47D乳腺癌细胞系,并通过IP进一步证明了在MCF7和T47D细胞中,ERα的RBD缺失导致其丧失了RNA的结合能力。之后,如图D所示通过染色质免疫沉淀和高通量测序可以验证这个RBD突变并不影响其DNA结合活性,;围绕 ERα 结合事件具有的相似峰值强度这些结果表明 ERα RNA 结合活性可能在转录后水平上调节不同的基因组,而与其作为转录因子的经典功能无关。



作者进一步开始验证ERα的RNA结合特性是否对癌细胞的生存起着关键作用。结果显示,ERα的RBD突变型MCF7和T47D乳腺癌细胞的增殖受到了抑制。最后作者使用了小鼠异种移植模型开展了活体研究,结果显示,消除了ERα的RNA结合能力也会抑制体内的肿瘤的发展。这些数据表明ERα的RNA结合能力有助于癌细胞的发展。



为了了解ERα和RNA关联如何在分子水平上促进乳腺癌的发展,作者采用了CRISPRi筛查方法,通过分析文库靶向在3UTR处与ERα相结合的基因。将单向导RNA(sgRNA)文库构建体转染到稳定表达多西环素诱导型非活性形式Cas9蛋白(dCase9)的MCF7细胞中,通过其对细胞增殖表型的影响,筛选出来了对乳腺癌生长所必须的237个转录本进行了基因分析。筛选结果揭示了一些与乳腺癌相关的主要功能簇,其中包含了细胞周期、对雌二醇刺激的反应、蛋白质合成和细胞运动等等。由于癌细胞在体内暴露于压力环境中,例如在肿瘤生长和转移形成过程中营养缺乏、缺氧和氧化应激物,作者关注到了一组参与对压力的适应性反应的 mRNA,并且许多压力适应性mRNA正在成为肿瘤发展和治疗反应的关键标志。

因此,为了了解 ERα作为RBP如何为癌细胞提供生存优势,作者对来自CRISPRi筛选的转录本进行了功能研究:抗凋亡蛋白髓细胞白血病1(MCL1)、真核翻译起始因子4γ2 (eIF4G2)、和转录因子X-box结合蛋白(XBP1)。MCL1属于BCL-2抗凋亡蛋白家族成员,可防止癌细胞死亡eIF4G2与eIF4G1(一种翻译起始因子)同源。eIF4G2 在压力下以无上限的方式参与对细胞生长和侵袭至关重要的 mRNA 的翻译XBP1 是UPR下游的关键转录因子,其 mRNA 被非常规处理以生成具有增强转录活性的剪接形式 (XBP1s) 。XBP1 的这种激活在压力下促进细胞存活。所有这些都与细胞对压力的反应有关。



CRISPRi筛选显示,沉默这些基因就会导致明显的细胞生长抑制。加dox处理后,与 CRISPRi筛选结果一致,MCL1、eIF4G2或XBP1的消耗导致显着的生长缺陷,表明这些被ERα结合的mRNA对乳腺癌适应性至关重要。



关于XBP1如何在癌细胞中受到调控,目前的认知还很匮乏。为了探索XBP1在癌细胞中是如何被调控的,使用带有ERα和XBP1 mRNA 的 3UTR的电泳迁移率变化测定(EMSA:当蛋白质跟核酸结合后,其在PAGE胶中的迁移速率会减慢,从而可以检测到活化的与DNA或RNA结合的蛋白转录或调节因子。),我们观察到 XBP1 3' UTR 与 ERα 的显着关联。在功能上,阻断 ERα 的 RNA 结合活性几乎完全抑制了 XBP1 mRNA 在 MCF7 细胞中内质网应激时的选择性剪接。这一现象在蛋白质水平上也很明显。



当内质网应激时,产生UPR信号,IRE1内切酶被激活并导XBP1 mRNA的切割,随后RtcB进行连接,这一个过程对于维持机体平衡十分重要。有趣的是,通过截短作者发现ERα可能通过其配体结构域(LBD) RtcB进行物理交联。由F图是基因组分析图上可以看出,XBP1 mRNA上的ERα结合区和RtcB结合的位置十分相近,并且突变ERα的RNA结合位点或者沉默RtcB,在应激时XBP1的剪接有明显的缺陷这些结果表明 ERα通过 RtcB控制XBP1选择性剪接。



研究表明,大约 20% 的 ERα+ 和接受内分泌治疗的个体在 ERα LBD 中获得热点突变,导致获得性内分泌抵抗。通过IP,作者观察到与 WT ERα 相比,RtcB 与携带这些临床相关突变(特别是 L536H)的 ERα 的物理相互作用显着增加,因此猜测ERα的功能突变体可能具有先前并未发现的一些功能,例如通过RtcB来促进XBP1的剪接。为了研究XBP1的剪接途径在乳腺癌中的功能作用,作者采取了药理学的研究手段,通过IRE1的抑制剂来特异性的阻断其核酸内切酶活性,同时保留了其激酶活性。结果显示,抑制 IRE1 的活性显着抑制了 ERα+ MCF7 癌细胞的生长。此外,非肥胖糖尿病小鼠(NOD)在服用IRE1抑制剂时可以显著抑制肿瘤的形成,说明了靶向疗法对于治疗乳腺癌具有一定的效果。

TamR-1是长期接受他莫昔芬治疗的MCF7细胞产生抗他莫昔芬乳腺癌细胞系,我们发现没有压力时,TamR-1细胞系内出现了XBP1的剪切现象,这种自然增强的XBP1的剪切可能也促进了癌细胞的生存和对压力的应对能力。接下来,作者通过超低附着板和无血清的培养基来模拟压力应激环境下培养细胞,结果显示IRE1的抑制可以显著增加他莫昔芬治疗后TamR-1细胞的凋亡。表明阻断 XBP1 剪接可以有效逆转他莫昔芬抗性这种促凋亡作用在 ERα 沉默后很大程度上受到抑制,揭示细胞对 IRE1 抑制剂的敏感性至少部分取决于 ERα。总之,这些数据揭示了先前未知的ERα 在 XBP1 剪接中的转录后功能,该功能具有临床相关性和乳腺癌靶向治疗的潜力。



除了mRNA的剪接之外,RBP与mRNA的结合也有可能有助于其它类型的转录后调节,例如mRNA的翻译和降解。作者通过阻断ERα与RNA的结合能力或者沉默ERα发现,eIF4G2和MCL1的蛋白丰度显著降低而不影响其mRNA的表达。此外,用蛋白酶体抑制剂MG-132阻断蛋白酶体导的蛋白质降解,并不能回补由 ERα RNA 结合缺陷诱导的 eIF4G2 和 MCL1 蛋白的减少。这说明,由 ERα RNA 结合不是在转录以及降解水平上来调控这俩分子。



为了确定 MCL1 和 eIF4G2 是否在翻译水平上受 ERα 调节,作者在蔗糖梯度分级分离中检查了它们在多核糖体(具有翻译活性的核糖体部分)中的分布。尽管 ERα RBD 的突变不会导致全局蛋白质合成的显着改变,但它会影响特定 mRNA 的翻译。从图EF中观察到 MCL1 和 eIF4G2 mRNA 在翻译活性较低的多核糖体(轻多核糖体)或翻译无活性部分中积累,但在对照 α-微管蛋白 mRNA中没有观察到。

综合上述证明,ERα与RNA的结合能在翻译水平上调控MCL1和eIF4G2的表达。



由于mRNA的翻译通常受到其5UTR和3UTR的调控,因此作者合成了两种新的结构:一种是仅在荧光素酶报告基因上游克隆的全长eIF4G2的5UTR。另一种是将其5UTR和3UTR分别合并到荧光素酶报告基因的上游和下游。以他们俩在雌激素受体α野生型和突变型MCF细胞中的荧光素酶 mRNA 水平为标准。通过比较携带WT和RBDmut ERα的细胞,可以观察到,虽然仅包含 5UTR eIF4G2的报告基因的活性没有显着差异,但当ERα不能结合RNA时,包含3UTR的报告基因活性显着降低,这说明了阻断ERα的RNA结合能力或eIF4G2转录本结合ERα的能力,足以抑制ERα导的eIF4G2翻译。最后,作者又从最开始的质谱数据中作者发现ERα还和翻译起始复合物的RNA解旋酶eIF4A1之间存在相互作用,IP验证了这一结果。通过使用eIF4A1的特异性抑制剂可以显著抑制MCL1蛋白的表达,说明了ERα对MCL1的调节至少是通过部分eIF4A1来实现的。

这些数据一起表明 ERα 是一个多方面的 RBP,涉及各种 RNA 转录后调控过程,包括翻译控制和 RNA 剪接。



由于ERα控制着eIF4G2、MCL1和XBP1的转录后调控,因此作者接下来想知道这些蛋白在人乳腺癌细胞中是否过度表达。通过比较乳腺癌患者的肿瘤和正常的邻近组织中的eIF4G2、MCL1和XBP1的蛋白表达丰度,结果显示在乳腺癌肿瘤组织中这三种蛋白的表达含量是远高于正常组织的。进一步在乳腺癌组织微列阵(TMA)上对这些蛋白进行IHC染色,与正常组织相比,这些蛋白在肿瘤组织中的表达是显著增强的。

接下来由于观察到ERα与RNA的结合能力在这几种他莫昔芬抗性的MCF7细胞中的都明显提高,因此作者推断ERα与RNA的结合能力可能是癌细胞的生存和产生耐药性的关键因素。与XBP1剪接相似, 耐药细胞与亲本的MCF7细胞相比,eIF4G2和MCL1蛋白丰度增加,但它们的转录水平没有显著变化。



将具有ERα的突变体和WT型的TamR-1细胞植入NSG小鼠体内,结果显示当ERα的RBD发生突变时,他莫昔芬能够显著的抑制肿瘤的发生,同时ERα与RNA的结合可以显著地抑制压力应激下所导致的细胞凋亡,并且沉默eIF4G2的细胞在应激状态下,凋亡率更高,当MCL1被抑制时,这种凋亡抑制效果也十分明显。这些数据都有力地表明,ERa导的转录后调节在癌细胞适应应激环境和维持细胞存活中起着重要作用。



作者在本研究中发现了ERα具有一类从未被人发现的全新作用,而它可能是导致癌症的关键。随后的实验也证实了这一点:研究人员们在癌症细胞系中发现,与ERα结合的mRNA,其编码的蛋白产物多少都与癌症发生有关。有些能抑制细胞凋亡,有些能促进细胞增殖,还有一些能帮助癌细胞逃脱药物的治疗。基于这个研究,科学家们能开发出更好的治疗药物,比如通过蛋白降解的方式彻底摧毁ERα,或是额外抑制它的mRNA结合能力。