感受态细胞的制备

      1.      挑取适当菌株的 E.coli  单菌落接种于 2ml SOC培养液中，37℃摇床过夜。

2.      取 0.5-1ml过夜培养的菌液转种到 50ml SOB中，18℃剧烈震荡，直到 A₆₀₀达

到 0.6,取出先水浴 10min。

3.      将培养物转移到 50ml离心管中，4℃4,000rpm/min离心 10min。同时在冰浴上 配制 TB溶液。

4.      弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5.       取 1ml刚配的 TB溶液打散菌体沉淀，再加入 15ml TB（1/3体积的起始培养液），

冰浴 10-15min，4℃4,000rpm/min离心 10min。

6.      弃上清，沉淀重悬于 4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴 10min。

7.      加入 280µlDMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。

8.      将菌液分装于 EP管中，-80℃或液氮冻存。（若冻存于液氮，取出后要非常迅 速地打开管口，以免 EP管爆炸伤人）

9.      取两管感受态细胞分别加入1µl无菌 ddH₂O（阴性对照）和 1µl纯质粒（阳性对 照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生

长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

                   SOB 的配制：

100×Mg⁺⁺溶液 10ml

溶解并加水定容至 1L，121℃×20min高低。

SOC的配制：

SOB+20 mM 葡萄糖，（80µl 20%葡萄糖与9.82ml SOB混合；注意：葡萄糖应先过滤除菌）

                  100×Mg⁺⁺溶液：

      MgCl₂﹒6H₂O（1M）  20.33g

      MgSO₄﹒7H₂O (1M)         24.65g

溶解并加水定容至 100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌

      TB 溶液的配制：

注：上述溶液使用前均需高压蒸汽灭菌处理或过滤除菌。

         0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：

称取 3.02g Pipes粉末溶于 80ml dd H₂O中，此时粉末不能完全溶解，用 10N KOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入 KOH直至达到所需 PH值。