2021.10.11 贾文慧分享“RNA的糖基化修饰”的故事大家好,今天给大家分享的这篇文章是今年5月份发表在cell上的一项工作,主题是RNA的糖基化。 先来介绍一下文章的通讯作者,Bertozzi教授现在就任于美国斯坦福大学人文科学学院,主要的研究领域是有机化学和界面化学生物学,她近期在糖生物学领域也颇有建树,这是她近期的一些研究成果。 糖基化修饰调控细胞内很多重要的生理功能。比如说,蛋白质的正确折叠和运输离不开糖基化的参与,此外,细胞膜上的糖蛋白和糖脂在细胞之间的交流过程中也扮演着不可或缺的角色。因此,传统的观点认为蛋白质和脂类是糖基化修饰的主要载体。这篇文章就颠覆了这个观点,他们首次报道RNA是除了蛋白质和脂类之外第三个主要的糖基化载体,并揭示了其在细胞膜表面可能具有重要的生理功能,所以说很多评论说这个研究是颠覆教科书的一个研究。 先给大家介绍一下这篇文章研究glycoRNA的一个基础,就是它标记这个glycoRNA的方式,利用的就是一个生物正交化学,生物正交化学简单来说就是说用一些非常小的基团去标记反应物,使得反应物的结构以及功能几乎没有变化,它们仍然可以在体内进行转化。 借用这张图来举个例子,这个物质是唾液酸聚糖,如果我们要研究这个物质在体内的转化以及分布,就得先给它做一个标记让它现形,生物正交化学便是一种非常好的方法,具体的操作就是我们给这个物质的前体也就是唾液酸前体加了一个非常小的修饰,就是这个叠氮基团,这个后缀足够小,不影响唾液酸前体在体内的转化。然后再注射一个带有flag标签的分子,这个分子还有一个特点是它含有碳碳三键,炔基,可以和叠氮基团发生反应,从而给这个唾液酸聚糖带上了flag标签,我们就可以监测这个糖分子在体内的分布情况。 正交的意思是说,在分子上做的化学修饰不仅不会影响其在体内的转化情况,并且它们也不和其他分子结合,像这里的叠氮基团以及炔基在生物体内都是非常惰性的,它们只会和彼此发生结合。当然还有一些别的要求,比如反应的速度要足够快,这样才能让我们修饰过的唾液酸聚糖在被完全代谢掉之前带上flag的标签,这种有机化学反应也叫做点击化学,就是有机反应物中的两个小基团发生化学反应,反应速度很快。 在今天要讲的这篇文章里,作者也是采用了叠氮标记的唾液酸去处理细胞,然后提取细胞的RNA,它们就发现在这些高纯度的RNA中存在叠氮物,之后它们就想是否RNA中还存在糖基化的修饰方式。 那么作者它们首先就是去研究了在RNA里是否存在一个糖基化的修饰,第一步就是用带有叠氮基团的唾液酸前体去处理细胞,处理细胞之后去提取高纯度的细胞RNA,它们的一个大概的protocal就是先用温热的trizol对RNA进行提取,然后硅胶柱除盐,之后再用蛋白酶K去消除蛋白质污染,再用硅胶柱除盐,当把RNA都提出来之后,下面需要做的就是用一些方法让RNA中的糖链显性,在这个课题中它们选用的标签分子是生物素,利用炔基和叠氮的反应将这个生物素分子结合到了RNA所带的糖链上。之后它们就用电泳对这些RNA进行了分析,Sybr是一种RNA或者单链DNA的染料,所以下面这个图它显示的就是RNA,上面这个图的Strep是链霉亲和素,链霉亲和素可以和生物素特异性的结合,可以用于检测和分离生物素化蛋白,所以上面这个图显示的是唾液酸聚糖的信号,也就是glycoRNA的信号。 我们可以看到,用唾液酸前体处理之后的细胞中的RNA出现了糖基化的现象,并且糖基化的信号和处理时间呈现时间依赖式的增强,48h糖基化的信号有所减弱可能是因为有部分带叠氮标签的唾液酸已经被代谢掉了。为了排除是杂蛋白所产生的糖基化信号的干扰,他们又用蛋白酶K对样品进行了处理,发现在蛋白酶K处理前后虽然glycoRNA的信号有所减弱,但是并没有完全消失,还是存在糖基化的信号,就说明之前所观察到的糖基化信号并不是由于杂蛋白而产生的,在RNA中也存在糖基化。 在确认了从Hela细胞中提取的RNA中存在一个糖基化的现象之后,作者又在其它多种细胞中验证了RNA存在糖基化这个现象。随后它们又用小鼠验证了RNA的糖基化是一种存在于生物体内的现象,它们分别在第2,4,6天给小鼠注射了带有叠氮标记的唾液酸前体,然后对小鼠肝脏和脾脏的RNA进行了提取和分析,结果发现在肝脏和脾脏中都存在一个RNA糖基化的现象,这就说明RNA糖基化是一种广泛存在于生物体内的现象,并且在不同的细胞和组织中具有不同的丰度。 在验证了RNA糖基化是一种广泛存在于生命体中的现象之后,因为我们知道RNA有多种类型,那么什么样的RNA它可以具有糖基化这种修饰呢,接下来作者就对RNA糖基化中RNA的类型进行了探究。 它们首先就预测RNA的糖基化是否发生在mRNA上,因为mRNA有非常广泛的翻译后修饰的类型。而在真核生物的mRNA中一个非常显著的特征就是它具有polyA的一个tail,所以作者首先就想采用polyA富集的方法,看能不能从总的RNA中提取出glycoRNA,答案是否定的。我们可以看到即使增加了inputRNA的上样量,采用polyA富集的方法仍然不能从唾液酸前体处理过的Hela细胞中提取到glycoRNA。并且它还通过对polyA富集的protocal每一步前后的产物进行RNA电泳去排除了在这个过程中出现的RNA降解,这些结果很好的说明了糖基化的RNA种类并不是很长的mRNA。 细胞内除了mRNA剩下的就是非编码RNA,非编码RNA一般分为长非编码RNA和短非编码RNA,所以接下来他们从长度的角度对于glycoRNA中RNA的类型进行了研究。她们采用了分馏的方法对于长度大于200个核苷酸和小于200个核苷酸的RNA进行了分离,结果发现糖基化的RNA几乎完全存在于小于200个核苷酸的类型中,为了进一步验证这个发现她们后面又对总的RNA进行了蔗糖密度梯度离心,发现糖基化的RNA也主要是存在于小RNA中。这部分他们就证实了小RNA是RNA糖基化的底物。 在验证了小RNA是RNA糖基化的主要类型之后,研究人员就对glycoRNA 的转录本进行了鉴定,想去看一下是否是所有的小RNA都会被糖基化,还是说糖基化只存在于小RNA中的一个特定的亚群里。它们采用蔗糖密度梯度离心的方法对细胞中的小RNA进行了提取和纯化,对这些小RNA进行测序和转录本分析之后发现,HeLa细胞和H9细胞中glycoRNA的富集呈高度正相关,并且主要集中在Y RNA,小核RNA,核仁小RNA和tRNA中。 研究人员发现在被修饰的RNA中有许多已知的和发挥关键作用的RNA,其中Y RNA家族最为显著,Y RNA会和一些核糖核蛋白结合,而这些核糖核蛋白又是很多自身免疫疾病的抗原,比如说系统性红斑狼疮。并且Y RNA又是在脊椎动物中高度保守的,尤其是5s RNA,因为Y5 RNA它既具有比较重要的生理病理意义又在脊椎动物中高度保守,所以作者就选择该转录本作为接下来的研究对象。 后续他们又构建了crispr-cas9敲除的Y5的293T细胞,我们可以看到,敲除细胞系的糖基化信号相比野生型减弱了一些,说明转录本Y5确实是糖基化的一个底物,但是和之前比对的结果一致,就是糖基化的底物还有一些其它的RNA转录本。 在对glycoRNA中RNA的成分进行一定程度的探索之后,接下来作者就想去研究一下glycoRNA上糖链的结构,就是糖基化RNA上的糖是什么糖,它的主要成分是什么。他们之前采用的这种带叠氮标签的唾液酸在体内会先转化成唾液酸,然后转化成带胞嘧啶核苷酸的唾液酸之后直接插入到糖链的末端,为了避免唾液酸在体内经过其它的途径被代谢掉,他们又选择了另一种代谢标记物9-叠氮唾液酸进行验证,9-叠氮唾液酸在体内可以直接转化成带胞嘧啶核苷酸的唾液酸。结果发现9-叠氮唾液酸处理后的细胞RNA上的标记仍然存在一个时间依赖性的趋势,这就说明在糖基化的RNA中确实是存在唾液酸的。 随后他们又采用霍乱弧菌唾液酸酶对细胞进行了处理,发现处理之后原本存在的叠氮信号就消失了,如果采用加热使得唾液酸酶失活,那RNA糖基化的信号又会恢复。在从通过水解唾液酸的角度去验证了随着唾液酸的消失,糖基化RNA中的叠氮信号也会消失,接下来他们从阻断唾液酸生物合成的角度去验证了这个现象,再加入一种膜上的唾液酸生物合成的抑制剂之后,发现随着浓度的升高,糖基化RNA中的叠氮信号也会消失,并且我们可以看到随着唾液酸生物合成抑制剂浓度的升高,glycoRNA的条带出现了一个上迁的趋势,是因为唾液酸的减少使得glycoRNA所带的糖链的负电荷减少,迁移速度降低。 接下来,他们又运用不依赖于代谢的方法对glycoRNA中的唾液酸进行了验证,采用了一种叫DMB的荧光探针,这个探针可以和多种游离的唾液酸结合,从而给他们带上荧光标记。随后它们采用高效液相色谱HPLC对荧光信号进行了分析,发现除RNA本身的峰之外,两种常存在于哺乳动物体内的唾液酸Neu5Ac和Neu5Gc的峰最为显著,当用唾液酸酶或者RNA酶处理样品之后,这两个峰会消失。随后他们对荧光信号进行了定量分析,发现H9细胞、Hela细胞和4188细胞中每μg RNA中唾液酸的含量大约是40,20和20pmol,我们看它这三种细胞系结果的差异文章中也给了合理的解释,人类细胞缺乏负责将Neu5Ac转化为Neu5Gc的功能性基因,而小鼠细胞中存在这一途径。相应地,我们发现小鼠4188个细胞glycoRNA中Neu5Gc水平高于HeLa或H9细胞。HeLa glycoRNA中Neu5Gc的存在可能来自于生长培养基中的牛血清;H9细胞在无血清培养基中培养。 在确认了糖基化RNA中确实存在唾液酸之后,他们就对于RNA糖基化的机制进行了探索,就是去看一下给RNA加上糖链的方式是否是和给蛋白加上糖链的方式是一样的。 先对蛋白质中的聚糖做简要介绍,蛋白质中主要有两种聚糖,就是N-聚糖和O-聚糖,N聚糖它是糖链和天冬酰胺或者精氨酸的侧链相连,而O聚糖它的糖链是和丝氨酸、苏氨酸或者酪氨酸侧链的羟基氧相连的。N-聚糖它对于真核细胞内蛋白质的正确折叠有十分重要的作用,它广泛分布于真核生物和古菌中,但在细菌中存在较少,而O-聚糖主要分布于高尔基体中。 他们在接下来的实验中采用了一种IdID CHO的突变细胞系,这种细胞系它就缺乏将尿嘧啶2磷酸葡萄糖或者尿嘧啶二磷酸乙酰葡萄糖胺转化成尿嘧啶半乳糖的能力,这种细胞是没办法产生N-聚糖或者O-聚糖的,因为它无法生成尿嘧啶乙酰半乳糖,它是O-糖基化起始所必须的,也无法生成尿嘧啶半乳糖,它对于N-聚糖的延长是必须的。所以这种细胞系中不存在糖基化的现象,它也常被用来研究蛋白质的糖基化。 在介绍了糖基化的类型以及使用的细胞系之后,我们看一下它是如何去探究RNA中糖基化的类型的。 我们可以看到用唾液酸前体处理的ldlD CHO细胞中很少有glycoRNA标记。然而,如果在培养基中加入半乳糖的话,glycoRNA的标记会重新出现,同时添加半乳糖和GalNAc可以进一步提高标记强度,随后他们又在人类髓性白血病K562细胞中运用crispr技术敲除了GALE基因进行验证,得到的结果也是类似的,说明RNA糖基化和蛋白质糖基化是类似的,GALE都是这个过程中一个非常关键的酶。 接下来作者用了一些糖基化的抑制剂对RNA糖基化的过程进行进一步探究,因为N-糖基化更为普遍,所以作者就先研究了N-糖基化是否是RNA糖基化的一种方式。这里的OST它是寡糖转移酶,是N-糖基化过程中一种非常关键的酶,它在N-糖基化中的作用是将14糖的糖链转移到天冬酰胺残基的N元素上,它首先是采用了一种OST的小分子抑制剂NG1-1去处理细胞,发现glycoRNA的信号和NGI-1呈现剂量依赖式的减弱,说明OST是在糖基化RNA的糖链合成过程中起到关键作用的。之后他们又对糖链合成的下游进行了干扰,采用了ɑ-甘露糖苷酶1和2的抑制剂,结果也是随着抑制剂的加入,glycoRNA的信号呈现剂量依赖式的减弱。 这里就说明RNA糖基化和蛋白糖基化有很大程度的相似之处,RNA糖基化采用的也是一种传统的N-糖基化的方式。 之前的数据表明,glycoRNA的糖基化方式是N-聚糖,并且其至少含有一个唾液酸残基。为了更加精确的了解聚糖的结构,他们设计了一种实验方法,是基于PNGaseF的,也就是一种糖苷内切酶,它可以将糖链和小RNA进行分离,然后用多孔石墨烯对产物进行固相萃取,可以使得聚糖和RNA分离,然后再用液相色谱和质谱联用技术对这些糖进行分析,通过和蛋白的糖数据库进行比对他们找到了107种在RNA上所存在的独特的聚糖。随后他们对这107种聚糖进行了分层聚类分析,发现这107种聚糖相比蛋白质中的聚糖分子量更小,分布也更加集中。接下来他们对于293细胞、H9细胞和Hela细胞中小分子糖的成分进行了进一步探索,发现在293T细胞和H9细胞中,RNA聚糖中海藻糖的含量相较蛋白聚糖中的更高,而Hela细胞RNA糖基化修饰中唾液酸的比例更高。 总而言之,它通过多孔石墨烯以及质谱分析发现,和之前的代谢物标记以及DMB探针标记结果类似,RNA中确实存在糖基化的修饰,并且虽然RNA糖基化的方式和蛋白糖基化的方式类似,但RNA糖基化的聚糖结构相较蛋白质而言有很大差异。 在探究了glycoRNA中RNA和聚糖的基本组成及结构之后,作者就想探究一下glycoRNA它在细胞中执行的功能,如果我们要了解一个生物分子的功能我们肯定首先要了解它的分布,所以接下来作者就对糖基化RNA的细胞亚定位进行了探索。 它们首先对细胞核、可溶性细胞质以及细胞膜生物膜进行了分离,发现只有在膜部分才检测到了glycoRNA的信号,说明糖基化的RNA和细胞膜及膜细胞器密切相关。随后,它们就想探究一下糖基化的RNA到底是存在于膜表面还是存在于内质网或者高尔基体那样的膜性细胞器的腔内,采用了一种方法就是先从代谢标记物处理过的293细胞中提取出其细胞膜和膜类细胞器,然后用Triton X-100进行处理,Triton X-100就可以对膜结构起到一个渗透和破坏作用,如果glycoRNA被限制在膜室的腔隙内,唾液酸酶只有在加入Triton X-100后才能接触到部分glycoRNA。在用DMB探针进行处理之后发现在没有Triton X-100的情况下,大部分的glycoRNA对唾液酸敏感,而加入Triton X-100之后,还会有少量的glycoRNA有响应,这部分实验结果说明大部分的glycoRNA是位于膜结构的表面的。 之前作者验证了glycoRNA是和细胞中的膜结构相关的,但是并不位于膜结构的腔内,而是处于膜表面,但是并不知道是什么膜的表面,所以接下来它们对于glycoRNA到底处于什么膜的表面进行了探究。因为细胞中有将糖蛋白运送到细胞膜表面的系统,所以作者一开始就猜测糖基化的RNA是否也是分布于细胞膜表面,接下来,他们利用一系列实验去验证了这个猜想。 之前已经有文献报道霍乱弧菌唾液酸酶可以选择性的切割活细胞膜表面的唾液酸,所以作者就向培养基中加入了霍乱弧菌唾液酸酶,发现确实可以减弱一些细胞中的叠氮信号,如果在37℃的情况下加入霍乱弧菌唾液酸酶,20min之后就会出现叠氮信号的减弱,60min的时候这种差异是最明显的,并且无论是贴壁的Hela细胞或者293T细胞还是悬浮的K562细胞,如果在培养基中加入霍乱弧菌唾液酸酶,都会出现叠氮信号的变化。这就说明glycoRNA是位于细胞膜表面的。 在用代谢物标记的方法确认glycoRNA是存在于活细胞表面之后,作者接下来又用非代谢依赖的方法对这个结论进行了验证。先对这种方法进行简单介绍,首先是带生物素标记的苯胺,生物素苯胺,它对于RNA有较高的亲和性,可以沉积在细胞膜表面的RNA附近。然后这里Strep-HRP是链霉亲和素-辣根过氧化物酶,链霉亲和素是可以和4分子的生物素发生结合的,辣根过氧化物酶可以和苯胺反应,而下面的凝集素是可以和细胞膜表面的糖链特异性结合的。所以说它这个方法就是利用凝集素和细胞膜表面的聚糖结合,然后利用凝集素连接的生物素招募链霉亲和素,链霉亲和素又可以通过生物素而招募苯胺,使得苯胺和辣根过氧化物酶发生反应,借助这种方法来对细胞膜表面糖基化的水平进行检测。 作者们首先筛选出了三种凝集素进行实验,一种是结合在糖链附近的凝集素,ConA,刀豆球蛋白,另外两种凝集素可以直接和糖链中的唾液酸结合。他们先用这三种凝集素去检测了一下Hela细胞表面糖蛋白的水平,以验证这三种凝集素和这个assay的有效性,结果发现单独加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶的组别并不能产生糖基化的信号,而另外三种凝集素都能有效的检测出细胞膜表面糖蛋白的水平。 所以接下来他们就用这三种凝集素在RNA中进行了实验。后续的实验他们都是在4℃的环境下完成的,以减少或消除囊泡运输、膜循环或细胞外成分的吸收对实验结果的影响。随后在RNA上的实验显示只有MAAII和WGA这两种直接和糖链相结合的凝集素能够产生信号,并且这种信号是RNA酶和唾液酸酶敏感的。之后他们又用Hela细胞的细胞裂解液而不是活细胞去做了下类似的实验,这个时候就没有细胞膜了,我们可以看到glycoRNA的信号显著减弱,这也说明glycoRNA大部分是存在于细胞膜上的,和之前的结果一致。 在明确了glycoRNA是主要位于细胞膜表面之后,作者们就想去探究一下这些细胞膜表面的glycoRNA到底扮演了什么角色。我们知道位于细胞膜表面的糖蛋白所执行的功能主要是细胞之间的交流,所以作者们开始就猜想glycoRNA是否也会执行同样的功能,他们就运用了一些现有的可以和细胞膜表面的glycoRNA发生相互作用的物质去研究其生理功能。一种是可以和双链RNA结合的抗体,为J2克隆,我去查了一下RNA抗体有很多种克隆,这个J2克隆是检测双链RNA的金标准,也被用来研究很多自身免疫疾病,比如说系统性红斑狼疮,也常被用来检测感染细胞的RNA病毒,由于报道说能够和J2克隆结合的双链RNA至少要40bp,而小RNA往往更小,所以作者就想先验证一下J2克隆和小RNA是否有结合,结合能力如何,就先做了个电泳迁移实验,发现在加入J2抗体之后,游离的Y5小RNA的位置发生了偏移,证明J2是和Y5小RNA有结合的,引起了其分子量的改变,而当加入竞争性结合的长一些的双链RNA时,小RNA发生偏移的比例减少。 在确认J2抗体能和Y5小RNA结合之后,作者就用流式去验证了Hela细胞中有20%左右是阳性的,并且随着RNA酶的加入,阳性率减少,如果加入RNA酶的抑制剂,对于该结果就有回复。 接下来作者通过共聚焦去验证了J2抗体是结合在细胞膜的表面。之前作者验证了RNA酶是会影响J2抗体和细胞的结合的,接下来作者就想去探究一下干扰糖链的生成是否会对J2抗体和细胞的结合造成影响。结果发现当用OST的抑制剂NGI-1处理细胞12h之后,J2抗体和细胞的结合呈现剂量依赖式的下降,这就说明J2抗体对细胞膜表面RNA的识别依赖于与其相连的聚糖。虽然J2克隆是直接和双链RNA结合的,但是聚糖对于它们的识别起到辅助作用,这里就初步验证了glycoRNA在介导生物识别、信号传递过程中可能扮演的角色。 在验证了J2抗体可以和细胞膜上的glycoRNA结合之后,作者接下来去验证了重组蛋白是否可以和glycoRNA中的糖链结合,因为之前已经验证了glycoRNA中的唾液酸比例较高,所以作者就首先验证了唾液酸结合免疫球蛋白凝集素型(Siglec)受体家族成员是否可以识别glycorna。除了因为之前已经验证过glycoRNA中是存在唾液酸的这个原因之外,作者选择这个家族的受体进行研究还因为这个受体家族分布广泛且具有重要的生理病理意义。 接下来,为了验证siglec受体是否可以和细胞膜表面的glycoRNA相结合,作者就用用流式去检测了Siglec重组蛋白和Hela细胞的结合,结果发现在12种商业化的siglec重组蛋白中,有9种都是可以和hela细胞发生结合的,在这9种中,有两种,就是siglec-11和siglec-14是RNA酶敏感的。这就说明Siglecs的配体不仅仅有糖蛋白和糖脂,还有糖基化的RNA。 这项研究它主要的工作总结非常简单,首先,他们揭示RNA也可以作为糖基化的载体,并且证实了glycoRNA在体内是广泛存在的,首次将糖生物学与RNA联系在一起,开辟了一个新的研究领域。其次,他们的研究发现GlycoRNA可以充当细胞膜Siglecs受体的直接配体。考虑到Siglecs受体在免疫调控中的重要功能,这意味着GlycoRNA在宿主免疫防御、肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等生理和病理过程中可能发挥重要作用,而这项研究则推开了这一研究领域的大门。 但是这项研究也留下了一些需要改进的问题,作者在文章中也提到了,他们选择的是带叠氮标签的唾液酸前体这种标记物作为切入点进行研究。但是并不是所有的聚糖都含有唾液酸,所以在这里报道的糖之外可能也有其它具有重要生理功能的糖与RNA结合。所以我们需要优化其他聚糖标记策略,使它们与RNA兼容,理想情况下允许检测天然的,未标记的糖基化RNA。还有就是作者只对glycoRNA的结构和成分进行了初步探索,并没有对其化学结构进行精确解析,日后对于glycoRNA中糖链结构的精确解析以及关于glycoRNA中聚糖数据库的建立对其生理和病理学作用的研究都有十分重要的意义。 |