DNA的酶切和连接

酶切

1.     酶切前确定待切样品的浓度,并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。

2.      在离心管中加入如下成分：

10×Buffer  1µl

待切样品     xµl

酶                     0.5-1µl

加水补足 10µl

3.     混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。

4.      将离心管置于 37℃中温育 1-3hr，若待切样品为 PCR产物，则可将反应时间适 当延长。

5.      用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶切

可选用二者活性都较高的 Buffer或者通用 Buffer，但要注意不能有星反应。）

连接

       1.  连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。

 2.      在离心管中加入如下成分：

10×连接 Buffer 1µl

待连接的样品（胶回收产物或 PCR产物，载体与片段的 mol比为 1∶3-5）

连接酶 0.5-1µl

加水补足 10µl

 3.     混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而 定，一般为 22℃ 1-3hr或 16℃连接过夜）。 连接完的样品可直接用于转化，也可放 4℃冰箱短期保存。