双向电泳操作步骤

水化上样(被动上样)

1.       从冰箱中取出 IPG胶条，室温放置 10min。

2.       沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 25px左右不加样，中间的 样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。

3.       用镊子轻轻撕去 IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。

4.       将 IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意:不要将样品溶液弄到 胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。

5.       放置 30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约 3ml(425pxIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。

6.       置等电聚焦仪于-20℃水化 11~15h。

第一向 等电聚焦

1.       将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加 ddH₂O 5~8µl润湿。

2.       取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的 滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

3.       将 IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正 极，确保胶条与电极紧密接触。

4.       在每根胶条上覆盖 2-3ml矿物油。

5.       对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

6.       聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品

水化盘中，-20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置 10分钟，使其溶解。 第二向 SDS-PAGE电泳

1.       配制 12%的丙烯酰胺凝胶。

2.       待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的 MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用 MilliQ水冲洗。

3.       配制胶条平衡缓冲液 I

4.       在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用 MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶 条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

5.       将胶条转移至样品水化盘中，加入 6ml(425pxIPG)平衡缓冲液 I，在水平摇床上 缓慢摇晃 15分钟。

6.       配制胶条平衡缓冲液 II。

7.       第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲 液 II中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

8.       用滤纸吸去 SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上， 凝胶的顶部面对自己。

9.       将琼脂糖封胶液加热溶解。

10.   在 100ml量筒中加入 TGS电泳缓冲液。

11.    第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上， 以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

12.   用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电泳缓冲液中漂洗数次。

13.    将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。

14.    用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.注意:不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

15.    放置 5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

16.    打开二向电泳制冷仪，调温度为 15℃。

17.    将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流

（5mA~10mA/gel/425px），待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再

加大电流（20-30mA/gel/425px）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

18.    电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止 污染胶面）。

19.   进行染色。