黄灿华教授 实验室

ELISA

一、包被抗原

     1. 50mM 的碳酸盐包被缓冲液pH 9.6溶解抗原使抗原浓度为 10-20 µg/ml

 加100 µl/孔到 96 孔酶标板4 oC  放置过夜。

     2.第二天弃去包被液后PBST洗涤 3每孔加入 150µl 1BSA 37oC 封闭1小时。

    3. PBST 洗涤 3 次后每孔加入 100 µl 不同倍比稀释度的血清并加入对照样品 37 oC 孵育 2 小时。

     4.  PBST 洗涤 5 次后加入 100µl 稀释后的HRP 标记的二抗37 oC  孵育 1 小时。

     5.  PBST 洗涤 5 次后显色剂显色 20 min 酶标仪上读取 A405吸收值。

二、包被细胞

1.      96孔培养板上接种细胞数为 1 x 104cells/well37过夜培养。

2.     第二天用 PBS洗涤培养板 2-3次。

3.      加入 125µl/well 10% Formalin1:10稀释,室温下固定 15 min

4.      ddH2O洗涤培养板 3并晾干储藏在 2-8oC备用。

5.      PBST洗涤 3每孔加入 150µl 1BSA  37oC 封闭 1小时。

6.      PBST 洗涤 3 次后每孔加入 100 µl 不同倍比稀释度的血清并加入对照样品 37 oC 孵育 2 小时。

7.      PBST 洗涤 5 次后加入 100 µl 稀释后的 HRP 标记的二抗,37 oC 孵育 1 小时。

8.      PBST 洗涤 5 次后显色剂显色 20 min 酶标仪上读取 A405吸收值。

 50mM 的碳酸盐包被缓冲液0.05mol/L pH9.6 碳酸缓冲液,4保存,Na2CO3  0.15 , NaHCO3 0.293 ,蒸馏水稀释至 100 ml

 ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)

        0.2M Na2HPO4 2.4ml

         0.1M 柠檬酸 2.6ml

         ddH2O 5ml

         ABTS 5mg

         H2O2(30%) 4 ul(用前加入)

注 意

一般做倍比稀释进行检测需要有相应的对照血清。不同的显色系统对应不同的光吸收值。