黄灿华教授 实验室

大肠杆菌质粒DNA的提取(碱裂解法)


此方法适用于小量质粒 DNA的提取提取的质粒 DNA可直接用于酶切、连接、PCR扩增等常规分子生物学反应但一般不适合转染等较高要求的实验。

1.      1.5ml细菌培养物于 EP管中1000rpm离心 1分钟弃上清液使细菌 沉淀尽量干燥

2.      将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl溶液 I (50mmol/L葡萄糖10 mmol/LEDTA pH8.025 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 振荡或枪尖吹打重悬细菌

3.      加入 200µl新配制的溶液 II (0.2mol/L NaOH1SDSm/v)盖紧 EP管口 快速颠倒离心管 5以混合均匀确保离心管的整个内表面与溶液II接触 不要涡旋置于冰浴中;(此步为裂解细菌裂解后的液体会拉出丝状

4.      加入 150µl预冷溶液 III (100 ml的溶液 III中含 60 ml 5mol/L乙酸钾11.5ml 冰乙酸28.5 ml H2O)盖紧 EP 管口反复颠倒数次使溶液 III 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后将管置于冰上 3~5分钟

5.      在最大转速下离心 5min取上清液于另一新 EP

6.      用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA振荡混合于室温放置 2分钟最大转 速离心 5分钟

7.      小心弃上清注意勿触动沉淀1ml70%乙醇洗涤沉淀12,000g离心 2

分钟弃上清 瞬时离心将附于管壁的液体吸出EP管开口置于室温 5~10min 使乙醇挥发用适量的 ddH2O 溶解。

8.      加入 0.5µlRNase10mg/ml37温育 5~10分钟

9.     电泳鉴定。


质粒 DNA的快速抽提适用于快速鉴定细菌中质粒的有无、大小或含量高低等 得到的质粒仅可用于电泳或转化不适于其它与分子生物学反应。

1. 取菌液 100~500µl10000g 离心 1min

2. 弃上清加入 20~50µldd H2O 重悬菌体

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇25241混匀

4. 10000g 离心 3~5min

5. 小心取出上清即可用于电泳鉴定或转化。