大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒 DNA的提取提取的质粒 DNA可直接用于酶切、连接、PCR扩增等常规分子生物学反应，但一般不适合转染等较高要求的实验。

1.      取 1.5ml细菌培养物于 EP管中，约 1000rpm离心 1分钟，弃上清液，使细菌 沉淀尽量干燥；

2.      将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl溶液 I (50mmol/L葡萄糖，10 mmol/LEDTA pH8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，振荡或枪尖吹打重悬细菌；

3.      加入 200µl新配制的溶液 II (0.2mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧 EP管口， 快速颠倒离心管 5次，以混合均匀，确保离心管的整个内表面与溶液II接触， 不要涡旋，置于冰浴中；（此步为裂解细菌，裂解后的液体会拉出丝状）

4.      加入 150µl预冷溶液 III (每 100 ml的溶液 III中含 60 ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 冰乙酸，28.5 ml H₂O)，盖紧 EP 管口，反复颠倒数次，使溶液 III 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上 3~5分钟；

5.      在最大转速下离心 5min，取上清液于另一新 EP管；

6.      用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置 2分钟，最大转 速离心 5分钟；

7.      小心弃上清，注意勿触动沉淀，加 1ml70%乙醇洗涤沉淀，用 12,000g离心 2

分钟，弃上清 瞬时离心将附于管壁的液体吸出，将 EP管开口置于室温 5~10min 使乙醇挥发，用适量的 ddH₂O 溶解。

8.      加入 0.5µl的 RNase（10mg/ml）37℃温育 5~10分钟；

9.     电泳鉴定。

附：质粒 DNA的快速抽提适用于快速鉴定细菌中质粒的有无、大小或含量高低等， 得到的质粒仅可用于电泳或转化，不适于其它与分子生物学反应。

1. 取菌液 100~500µl，10000g 离心 1min；

2. 弃上清，加入 20~50µldd H₂O 重悬菌体；

3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）混匀；

4. 10000g 离心 3~5min；

5. 小心取出上清即可用于电泳鉴定或转化。