Tunel检测细胞凋亡原理和步骤

实验原理：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用.这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

实验方法：

对于贴壁细胞或细胞涂片

a. PBS或HBSS洗涤一次。

b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)固定细胞30-60分钟。

d. 用PBS或HBSS洗涤一次。

e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

f. 转步骤5。

对于悬浮细胞或细胞悬液

a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。

b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。

e. 转步骤5。

对于石蜡切片

a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。

c. PBS或HBSS洗涤3次。注意:这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

d. 转步骤5。

对于冷冻切片

a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。

b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

d. 转步骤5。

配制TUNEL检测液

参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意:配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。

对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片

a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意:孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。

c. PBS或HBSS洗涤3次。

d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

对于悬浮细胞或细胞悬液

a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。

c. PBS或HBSS洗涤2次。

d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。

e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。