免疫组化组织细胞的取材
从大体标本上切除适量的组织材料进行研究就是取材。取材不仅在免疫组化而且在常规病理检查中也十分重要。用于免疫组化的组织一般取材大小为1．OcmXl．OcmX0．2cra。取材时应剔除脂肪和钙化，否则会影响切片，出现假阳性或假阴性结果。
组织标本包括动物标本、手术活检标本、尸体解剖标本及细胞标本等，有关各种标本的取材方法分述如下。
一、动物的致死法及取材
(一)致死法
(1)空气栓塞法 向动物静脉内注入一定量的空气，使动物很快死亡。一般适用大动物，例如兔、犬、猫等动物。
(2)麻醉法 可将浸有乙醚或氯仿(三氯甲烷)的棉球连同动物一起放人密闭容器内进行麻醉，也可用4％戊巴比妥作静脉注射，或用20％氨基甲酸乙酯做腹腔注射。适用于鼠等小动物。
(3)断头法 用剪刀剪去动物的头部，待血液流出后立即取材。适用于小动物。
(4)去头法 用重物猛击头后部或将动物头后部猛撞桌沿。
(5)股动脉放血法 动物麻醉后，切开股动脉放血致死。
(二)取材注意事项
(1)最好在动物心脏还在跳动时立即取材，并迅速投入环保组织固定液内。脏器的上皮组织易变质，争取在死后半小时内取材完毕，否则免疫组化染色时会产生背景染色。
(2)切取组织使用的刀、剪要求锋利，避免来回挫动组织。因动物组织质脆，因此夹取组织时切勿 用力过重，以免挤压损伤组织。
二、尸体解剖的取材
尸体解剖的取材应根据实际需要进行，一般取材部位和数量如下。
(1)心和大血管 右心室一块，左心室一块，主动脉一块，取材部位可在距主动脉瓣5cm处。
(2)肺 右下叶一块，切成正方形；左下叶一块，可切成长方形。
(3)肝 右叶一块，切成正方形；左叶一块，切成长方形。
(3)脾 一块。
(4)胰 一块。
(6)肾 两肾各一块，包括皮质、髓质和肾盂。右肾一块切成正方形，左肾一块切成长
(7)膀胱 一块。
(8)肾上腺 左、右各取一块。
(9)消化道 食管一块，胃窦部一块，小肠一块，淋巴结一块，直肠一块。
(10)骨 脊椎骨一块。
(11)胸腺 一块。
(12)子宫 宫颈和宫体数块。
(13)睾丸或卵巢 各一块。
(14)脑 左侧运动区一块，左侧豆状核一块，小脑一块。
(15)脑下垂体 一块，前叶或包括前后叶。
如有较严重或复杂病变时应适当增加取材数量，以便彻底检查而作出正确诊断。
三、活检标本的取材
(一)常规活检标本的取材
应注意病变的部位、形状、大小、颜色以及与周围组织的界限，有无完整的包膜。取材时应取病变部位、病变的切缘、病变与正常组织交界处以及远离病灶的正常组织。取材用的刀剪应锋利，避免挤压组织；组织的切面应平整，组织切忌过大、过厚，否则不仅浪费试剂，而且会造成固定、脱水不良而影响镜下观察。
(二)肾穿刺标本的取材
进行穿刺取得组织后，立即用生理盐水或PBS冲洗数次去除血迹，并迅速判断所穿组织是否为肾组织(肾组织应为暗红色)。当确定为肾组织后，立即将组织置于木板上，迅速测量其长度；用解剖显微镜或放大镜进行观察，以区别皮质和髓质，并观察标本是否有肾小球。在解剖显微镜下，肾皮质较淡，皮质区可见一些分布不规则、朦胧的红色小点，此即为肾小球。使用解剖显微镜可帮助区别组织，作出准确的判断，使肾活检可靠。穿刺所取得的标本用手术刀片切开，并迅速固定，一半放人装有光镜固定液的青霉素小瓶内，另一半放人装有电镜固定液的小瓶内，均置于冰瓶内保存。
(三)小标本的活检取材
小标本常见为宫颈、宫内膜、鼻咽、口腔、喉以及各种内窥镜所取得的组织。它们体积较小，因此取材时要用擦镜纸包起来再进行固定、脱水，特别是由胃镜、肠镜等所取的组织，取材时一定要滴上伊红，以防止丢失。活检组织多用活检钳夹取，常因过度挤压而变形。病灶表面有出血坏死，活检时难于采取到深部组织。因此，活检钳的刀口必须锋利，活检时必须采取主要病灶区，尽量避开坏死区。
免疫组化组织细胞的固定
凡需进行病理研究的标本均需进行固定。将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。
不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。
固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。
一、固定液的种类
较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。固定液分为简单固定液和混合固定液。 因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。
二、固定的方法
1．浸泡法
这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。
2．蒸气法
比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。
3.注射、灌注固定法
主要适用于动物实验标本的固定。将固定液注入血管，以达到充分的固定。经血管分支到达整个组织或全身
(1)局部灌注固定 固定肺组织可将固定液从气管或支气管注入，注入速度不要太快，用力均匀，注入量适当，以免胀破肺泡。固定眼球组织可从眼后房注人固定液。固定肝、肾组织则可从肝、肾动脉注入固定液，同时切断其静脉使得血液排出。脑组织的固定，必须先麻醉动物，分离颈动脉，注射器的针尖向着头部的方向注入固定液。
(2)全身灌注固定 较大的动物往往采取输液方法，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，将另一侧相应的静脉切开放血。固定液的输入量因动物而异，兔、猫约500～1000ml，猴、狗约1000—2000ml。
4．微波固定法
近几年来微波固定法一直可见报道。经微波固定的组织具有收缩较小、核膜清晰、染色质均匀、分辨清晰等特点，但必须严格控制微波固定的时间和温度。
免疫组化组织细胞的脱水
(一)概述
组织经固定和水洗后，会有大量的水分留在组织中，而水又不能与苯融合，因此必须在透明前脱去组织中的水分。用某些溶剂将组织中的水分置换出来的过程称为脱水。对于不同的组织应分开脱水，特别是一些易脆的组织(如肝、脾等)应严格掌握脱水时间，防止在无水酒精中停留时间过长。对于动物组织，应比人体标本相应缩短脱水时间。脱水应按照从低浓度到高浓度的过程，否则标本直接进入高浓度溶液中极易引起组织的强烈收缩或使组织发生变形，从而影响切片，还会造成免疫组化实验过程中的脱片。
(二)脱水剂的种类
(1)乙醇 最常用的脱水剂，脱水能力强，并能使组织硬化，与二甲苯能混合。其缺点是在高浓度乙醇，特别是无水乙醇中停留时间长会引起组织收缩、变脆而影响后续的切片。尤其是应用全自动脱水机，因是加压抽真空并加温脱水，在高浓度乙醇中停留时间更不能太长，应经试验摸索出适合自己单位脱水需要的时间，不能盲目从书本上套用脱水时间。脱水时，应从低浓度向高浓度梯度进行。一般是人体组织从?5％乙醇开始，对于小动物、胚胎及柔软的组织可从30％乙醇开始脱水。只有脱水充分，才能在透明剂中透明。若是人工脱水，必须在加盖的容器内进行，尤其是高浓度乙醇很易吸收空气中的水分，阴雨天更应注意。在透明前最好将组织取出，用滤纸吸干后再透明。
(2)丙酮 脱水作用比乙醇强，但对组织的收缩也大，毒性强，价格高，因此一般不用于常规组织的脱水，主要用于快速脱水及固定兼脱水。此时应注意个人防护，最好在带有抽风功能的装置中进行，脱水时间1～3h左右。丙酮还可作为染色后的脱水剂，用于甲基绿—派洛宁显示DNA及RNA。
(3)正丁醇 为五色液体，微溶于水，在100ml水中只能溶解8．3g，故脱水能力较弱，但能与水、乙醇及石蜡混合，因此经正丁醇脱水的组织可直接浸蜡。它的优点是很少引起组织的收缩及变脆。一般用法为：组织经固定及冲洗后，依次人50％、70％、80％乙醇中脱水，然后人正丁醇，12～24h后浸蜡。使用时也应注意防护。
(4)叔丁醇 异丁醇的一种，可与水、乙醇、二甲苯混合，可以单用或与乙醇混合使用，是一种使用较广的脱水剂，它不会使组织收缩或变硬，不必经过透明而直接浸蜡。电镜上为常用的中间脱水剂。
(5)环己酮 沸点为140~C，冰点为一40~C，密度与水相似，无毒，可与苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂混合，也是石蜡溶剂，可代替纯乙醇脱水后直接浸蜡，组织不会变硬，不需经二甲苯透明。
(6)松脂醇 组织固定后按常规经各浓度乙醇至95％乙醇中，按下列顺序进行脱水和 透明处理：
①浸入等份95％乙醇和松脂醇的混合液中，待组织块下沉后转入下步处理；
②95％乙醇1份加松脂醇2份的混合液中浸泡1h；
③95％乙醇1份加松脂醇3份的混合液中浸泡1h；
④松脂醇I、Ⅱ、Ⅲ中各浸泡1h；⑤松脂醇5份加石蜡1份的混合液中浸泡lh，然后浸蜡包埋。多用于经乙醇或Carnoy液固定的组织。经松脂醇处理的组织收缩较小，发生硬化也少。
中性缓冲福尔马林影响HE染色
用中性缓冲福尔马林后，细胞核颜色的确不够鲜艳，可在染苏木素前用3%冰醋酸媒染10分钟，会有所改善。
免疫组化组织细胞的固定（续）
三、固定的注意事项
1．固定液的量
固定组织时，必须有足够的固定液，一般为组织块体积的10～15倍。固定用的容器必须足够大，组织材料不要太多，避免组织中的水分渗出而影响固定液的浓度。
2.固定的组织必须新鲜
组织取材后应立即固定，否则，组织易收缩变形，并发生自溶现象。
3.组织块的体积
组织块的体积宜小而薄，一般用于免疫组化的组织大小宜为1．OcmXl．OcmX 0．2cm。组织太大，内部得不到充分固定，导致组织结构破坏，给切片带来一定的困难，还增加非特异染色，同时浪费试剂。
4．组织固定后的冲洗
组织固定后，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水。特别对于长时间固定的标本应用流水冲洗，尽可能减少色素沉着。对于混合固定液固定的组织，更要及时冲洗，否则将影响免疫组化切片的质量。
四、影响固定的因素
1．温度
一般固定液固定效果随温度升高而加强，温度一般在-70～37℃之间，?以室温22℃常用。某些酶的固定要求在37℃以下进行，而某些病毒的固定则要在低温下进行，如用丙酮在-20一-40℃之间固定30min最佳。对于临床活检标本，固定时间要求短，实践发现用中性甲醛在40℃左右固定2～3h即可。
2．浓度
10％中性甲醛、4％多聚甲醛最合适，乙醇最常用浓度为95延。在37℃或室温固定，适合于许多蛋白质、抗原，并能保持其与抗体的反应能力。70％的乙醇固定能力最强。
3．固定时间
固定时间要视组织块的大小及固定液的种类、浓度、温度而定。组织块越大，固定时间越长；反之，组织块越小，固定时间越短。固定液的穿透力与浓度成正比，固定的时间与温度成反比。总之，固定的时间应根据条件而定。没有任何一种固定液适合于所有组织的固定，应根据条件选择合适的固定液，可以用多种固定液固定作对比，找到比较切合本单位实际的固定液。
免疫组化组织细胞的透明
(一)组织透明的目的及注意事项
组织经某些化学试剂作用后，呈现不同程度的透明状态称为透明。组织透明的目的是便于浸蜡包埋，因为很多脱水剂不能与石蜡混合，必须通过透明剂的作用才能使石蜡浸入组织中，因此透明剂必须既能与脱水剂混合，又能与石蜡混合。如果组织透明不彻底，就会导致浸蜡不良。
组织透明不彻底的原因主要是固定、脱水不良以及透明剂的纯度不够造成的。透明剂的体积应为组织体积的5～l0倍，并注意定期更换。应用全自动脱水机、标本量又较大的单位，应争取每星期更换一次透明剂；标本量小、用人工脱水的单位，在脱水结束后，可以将组织块取出，用滤纸吸除组织中多余的脱水剂，再放人透明剂中，并观察组织是否透明 而决定是否应更换透明剂。
(二)常用透明剂的种类
（1）因透明剂大多有强毒性和刺激，欧美主要国家目前都已改用环保透明剂，逐步禁止使用二甲苯类有毒透明剂。西奈山环保组织透明剂系水果油调配而成，纯天然，无毒有水果香味，透明效果好，正逐渐在各大医院推广使用。
(2)二甲苯 为最常用的透明剂，毒性刺激性大、易挥发，不溶于水，透明力强，易使组织收缩、质脆， 故组织在二甲苯中停留时间不能太长，特别是动物组织更应严格掌握透明时间。二甲苯在用于染色后的透明时，组织应先浸于二甲苯和苯酚混合液(3：1)后，再进入二甲苯透明。
(3)甲苯和苯 性质与二甲苯相似，但透明速度较慢，对组织的收缩程度小。
(4)氯仿 毒性大、不易使组织变脆，其透明能力较二甲苯差，因此透明时间相对较长，易挥发，多用于大块组织的透明。
(5)香柏油 剧毒、是一种柏树树脂，能溶于乙醇，是乙醇脱水后的良好透明剂，但透明时间 长达24h。
(6)苯甲酸甲酯 有毒 难溶于水，溶于醚，折光率1．517。经95％乙醇脱水后的组织可直接 进入苯甲酸甲酯透明。也可用于火棉胶切片。
(7)苯胺油 有毒、又称安尼林油。微溶于水，能与醇、醚、苯以及其他多种有机溶剂混合，应注意避光保存。
免疫组化组织细胞的包埋
(一)石蜡包埋法
石蜡是组织切片技术中应用较广泛的包埋剂，切片石蜡须是经多次过滤后呈半透明状的 优质石蜡，熔点为56—58~C的蜡较适宜。
包埋时应注意包埋面必须平整，破碎组织应聚集在一起包埋，并注意一些特殊的包埋 面。包埋蜡的温度应与组织块温度接近，过高会烫伤组织，过低使组织和石蜡分离，不利于切片。
(二)体液包埋法
体液标本，如痰液、胃液、尿液、胸腹水等，也可行石蜡包埋。痰液应选用含血液的部分或较为可疑的实体部分，滴上伊红后，用皱纹纸包好，用10％的中性甲苯固定，再经常规脱水、透明、浸蜡并包埋。新鲜的胃液、尿液、胸腹水等体液标本，倒去上层的澄清液体，将下面浑浊的液体放人离心管中，以2000～3000r／min离心15min，倒去上清液后，以环保组织固定液固定下面的沉淀物，然后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。
(三)快速石蜡包埋法
本法适用于没有冰冻切片设备，进行术中病理诊断的单位，取材时注意应小而且薄。主要过程如下。
(1)将组织放人环保组织固定液中
(2)人纯丙酮I，3min。
(3)人纯丙酮Ⅱ，3min。
(4)人苯，2min。
(5)人石蜡，5min。
(6)快速包埋后切片、染色封固。
(四)冷冻干燥包埋法
冷冻干燥包埋法的基本原理是将新鲜组织低温速冻，再利用真空排除组织内所有水分，使石蜡直接浸入组织内而制成蜡块。其优点是可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白质变性和酶失活。
基本过程：新鲜组织在液氮中速冻后，真空抽气，以排除组织内的水分，然后将充分干燥的组织用甲醛蒸气固定，再将固定过的组织浸入石蜡内浸蜡，最后石蜡包埋。此法包埋的蜡块可用于免疫荧光和免疫酶标记，也可用于放射自显影及IGSS方法。
免疫组化组织浸蜡切片
组织经过脱水、透明后置人石蜡中，使组织变硬而利于切片的过程称为浸蜡。
为了使石蜡完全取代组织中的透明剂，必须经3次浸蜡，每次时间为1h左右。本实验 室蜡的熔点一般为56～58~C，这种熔点的蜡较适中，经过此种石蜡浸透，包埋后切片顺利，连续性好，展片平整。
切片是免疫组化准备工作的最后一步，其切片质量相对于常规组织切片来说要求更高，要切得薄而平整，并注意不可有刀痕。主要有石蜡切片、冰冻切片、塑料包埋切片、碳蜡切片等。在切片前还需对载玻片进行相应的处理。
一、载玻片的处理
免疫组化染色时间长，特别是双PAP、免疫金银染色等方法，所需时间更长，并要反复洗涤，切片在试剂中长时间浸泡，经多次洗涤，极易造成脱片而影响实验的结果。需采用以下方法处理：载玻片先置于洗洁液(或洗衣粉溶液)中煮沸30min，清水洗干净后放人清洁液中浸泡12—24h，漂洗，用蒸馏水清洗后置于烤箱内干燥，然后涂以切片黏合剂。
切片黏合剂的配制方法如下。
(1)明矾—明胶的配制方法 明矾、明胶各1g，加入到100ml 1％甘油中，加热至70~C熔化，并搅拌混合至完全透明状，将切片浸入此液中几分钟，也可以涂在载玻片上，36℃2h后即可使用。
(2)合成乳胶—聚醋酸乙烯乳液的配制方法 合成乳胶是一种高分子乳化聚合物，具有高度黏合力，无毒、无臭、无腐蚀性。取合成乳胶10份，加蒸馏水90份，搅拌成10％的使用液备用。载玻片可以浸泡此液中，也可以涂片。浸泡时浓度最好稀一点；用于涂片最好浓度高一点，涂完后在36~C中5h后即可使用。
(3)多聚赖氨酸 0．05％多聚赖氨酸(分子质量200kDa)水溶液，临用时现配，电吹风吹干即可使用。
(4)进口切片黏合剂 此胶属树脂胶，国外作为木材的黏合剂。涂胶方法同(1)，即直接涂片或浸入涂片。一般买回来的黏合剂需10％稀释。
(5)甲醛—明胶 1％明胶5mi，2％甲醛5ml，混合即可涂片。
(6)明胶—铬明矾—戊二醛黏合剂 载玻片在10％Extron中65℃清洗60min，用热水冲洗60min，双重蒸馏水洗2次，空气干燥，然后浸在0．5％明胶—0．05％铬明矾液(注：先将0．5％明胶60~C溶解，冷却后加入铬明矾)中，40~C浸浴lmin，空气干燥，用0。2％戊二醛(PBS配制)固定60min，PBS洗后，切片空气干燥，于4~C保存。
(7)白胶—多聚赖氨酸混合液—取进口切片黏合剂10ml，加10mg多聚赖氨酸混匀，即可用于涂片。
二、石蜡切片
石蜡切片不仅是常规病理中的重要切片形式，也是免疫组化研究中较常用的切片形式，它能满足免疫组化的连续切片要求。为了便于染色及观察，切片时应注意：①连续切片时应按顺序分离及贴片，不应颠倒；②贴片时应距载玻片一端至少1cm，一般靠一边，以利于显色安全；③用于免疫组织化学染色的蜡温应为56—58℃，切片水温在40℃左右，应先置于冷水中，然后再移人热水中，这样可以使切片能顺利展平；④切片刀要求快，切片要薄，无刀痕和皱褶，在染色时可减少非特异染色；⑤烤片时要注意，抗原性较强的组织可在60℃烤3—8h，抗原较弱的组织可于37℃恒温箱内过夜；⑥切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定簇的保护。
三、冰冻切片
冰冻切片的优点是能较完整地保存抗原性。组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片的处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片就能最大限度地保护抗原。缺点是在冷冻过程中形态结构可能破坏，抗原易弥散，不能用于常规病检及回顾性研究。 如希望保存较长时间和避免抗原弥散，可用环保组织固定液在4度固定5-10min。
目前大多采用恒冷箱冰冻切片机，将新鲜组织置于-25℃左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。其注意事项：①切片刀要快，并且预先冷冻，恒冷箱的温度一般调至-25℃左右，不能太低，否则组织表面易出现冰渣；②抗卷板的位置要适中，否则难成片；③贴片时动作轻而迅速，否则易出现皱褶；④组织从液氮内或-80℃取出，必须进行温度平衡后才能切成片，切完的组织如下次还用，应用冷冻头在没有完全溶解前取下，密闭后低温保存。
切片后，应用电吹风冷风吹干或自然干燥。如在短时间内用，可全部进行固定，固定后，PBS洗，吹干后低温冰箱内保存。
四、碳蜡切片
碳蜡切片与石蜡切片相似，碳蜡是水溶性蜡，因此切片时不需用水展片，只需贴在载玻片上，吹干即可。切好片应把碳蜡块密闭保存在干燥器内。另外，碳蜡切片不需脱蜡至水，切片可直接入水进行各种染色。
免疫组化石蜡切片的脱蜡
石蜡切片脱蜡这个步骤，操作时经常被忽视，其实这是很重要的一个步骤，脱蜡是否完全直接影响后面的抗原抗体结合。
常规是切片放在二甲苯中3-5min，两次，必要时可升高温度，尤其是没有使用低熔点石蜡包埋的切片。因为二甲苯毒性比较大，刺激性特别强，需在通风柜中操作，少部分同仁为了尽量缩短接触二甲苯的时间，导致脱蜡不完全。
现在国外实验室大多不使用xylene 二甲苯这个有毒试剂，而改用环保组织透明液，可在普通实验台上操作，可确保脱蜡完全。很多国外文章漂亮的片子，都是这些细节决定的喔！
石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理：
抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
2.3 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。m皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10
3、抗原热修复：
如果组织固定没有使用甲醛类固定液，使用的是环保组织固定液，如西奈山环保组织固定液，一般情况下，可省去抗原修复过程，因非醛类固定液，不对蛋白形成大量的交联，不会掩盖抗原族。
可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 ±枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
4、免疫组化染色步骤：
（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
1）石蜡切片脱蜡至水。
2)3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3) 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
4) 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5)PBS冲洗，5分钟×3次。
6)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7)PBS冲洗，5分钟×3次。
8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9) PBS冲洗，5分钟×3次。
10) 显色剂显色（DAB或AEC）。
11)自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2
免疫组化实验过程中的要点和技巧
1．固定：常用4%的多聚甲醛固定液，最好用环保组织固定液，安全，无毒。对于冰冻切片，环保组织固定液有更好的优越性；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，应用新型环保组织透明液，不含二甲苯等有毒试剂，可避免切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。
11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。
12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
14．在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。
免疫组织化学组织细胞的组织浸蜡
组织经过脱水、透明后置人石蜡中，使组织变硬而利于切片的过程称为浸蜡。
为了使石蜡完全取代组织中的透明剂，必须经3次浸蜡，每次时间为1h左右。本实验 室蜡的熔点一般为56～58~C，这种熔点的蜡较适中，经过此种石蜡浸透，包埋后切片顺利，连续性好，展片平整。
免疫组化操作制度
1、设置单独的实验室。
2、必须有专用的冰箱，天平和pH计，并定期校对。
3、实验用玻片，器皿必须清洁。经过泡酸处理，清洗干净。
4、即用型试剂必须放入4度冰箱内，并每天对冰箱温度进行检查并登记（包括-80度和-20度冰箱）。
5、试剂在有效期内使用（自己配制的试剂，也需标明有效期），使用前必须核对有效期。
6、专用的脱蜡，脱水流程。
7、设立阳性和阴性对照。
8、根据各种抗体具体要求进行抗原修复。
9、新抗体必须摸索出最佳稀释度。
10、孵育时间，温度根据各种抗体的具体要求操作。
11、DAB显色必须在镜下观察。
12、复染后经酒精充分脱水，环保组织透明液透明湿封。
13、封片时不得有气泡，不得有树胶外溢。
14、标签必须贴于玻片左侧，编号字迹必须清楚。
15、制片工作一般应在48小时内完成。
16、切片完成后交付医师时必须按照记录当面清点。
17、对使用的免疫组化抗体进行克隆号、稀释比、配制时间记录。
免疫组化抗原修复
选择应用抗原修复技术一般用于经甲醛固定的石蜡切片标本中，经甲醛固定的部分组织细胞在进行免疫组化染色时其敏感性明显降低，其原因（1）（1）再用甲醛固定过程中形成醛键而封闭了部分抗原决定族；（2）甲醛在保存过程中会形成羧甲基，而封闭抗原决定族；（3）在用固定剂固定时，会使蛋白与蛋白之间发生交联，也可能会封闭抗原决定族。因此，在染色时，有些抗原须经修复或暴露即将固定时分子之间所形成的交联破坏而恢复抗原的原有空间形态。因此免疫组化推荐使用不含醛的环保组织固定液
常用抗原修复方法：
1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法
（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。（3）试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源总时间控制在5－8分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。
②必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高导致组织脱片。
③高压锅离开火源后必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
④为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。⑤缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
2．柠檬酸缓冲液微波抗原修复法
（1）适用范围：同方法1。
（2）仪器设备：微波炉、耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（＞500ml）于微波合中，微波加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档或中档继续微波处理15－20分钟，取出微波合冷却至室温，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①微波加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到微波结束总时间控制在15－20分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。
②必须使用耐高温塑料切片架，不能使用铜架或不锈钢。
③微波过程中，如果缓冲液蒸发而量减少，无法浸泡到组织片，应该适当加上一些蒸馏水，以保证组织片都能浸泡在缓冲液中，继续微波。
④微波结束后，必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
⑤为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。
⑥缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3．柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法
（1）适用范围：同方法1，效果最差。
（2）仪器设备：电炉、烧杯（1000ml）、不锈钢或耐高温塑料切片架。（3）试剂：0.01M柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于烧杯中，放在电炉上加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮沸20分钟，烧杯离开电炉后冷却至室温，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①煮沸时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到烧杯离开电炉总时间控制在20分钟为好，时间长可能会使染色背景加深。
②必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液pH值增高导致组织脱片。
③微波结束后，必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
④为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。
⑤缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
4．EDTA抗原热修复法——水浴法
（1）适用范围：同方法1。
（2）仪器设备：铝锅或铁锅、电炉、烧杯（1000ml）、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：1mM EDTA抗原修复液 pH8.0。
（4）操作步骤：
①常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；
②取一定量1mM EDTA抗原修复液 pH8.0于烧杯中，放入铝锅或铁锅，盖上锅盖进行热煮（注意防止EDTA液从烧杯中倒出）直至锅中水沸腾（此时烧杯内的EDTA液不会沸腾）；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，继续煮沸20分钟，煮好后从锅中取出烧杯冷却至室温，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。进行组化的下一步。
（3）注意事项：
①微波结束后，必须等缓冲液冷却后，才能把切片取出。
②为防止组织脱片，玻片必须经清洁处理后，包被0.01％多聚赖氨酸（poly-L-lysine）或APES(3-aminopropyl-triethoxy silane)。
③缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，避免切片干涸（抗原可能完全丢失）。用过的EDTA缓冲液不能反复使用。
5．酶消化法抗原修复法（常用胰蛋白酶和胃蛋白酶）
（1）适用范围：同方法1，酶消化可以大大增强免疫组化染色效果。胰蛋白酶（trypsin）一般为0.05％～0.25％，常用0.125％。胃蛋白酶（pepsin）常用0.4％。
（2）操作步骤：
①常规组织切片经环保组织透明液脱蜡、梯度酒精水化至水，；
②阻断内源性过氧化物酶（也可以在消化处理后进行阻断），用PBS（pH7.2－7.4）冲洗3次，每次3分钟。用吸水纸吸干组织周围的水分，界限笔沿组织外周划圈，再滴加酶消化，37℃15－20分钟（注意加酶前保持组织湿润，不能干，加酶后注意不要使液体流出圆圈外，酶消化时间可以根据情况调节），PBS冲洗3分钟×3次，进行组化的下一步。
（3）注意事项：配好的消化酶溶液至4－8℃冰箱保存，避免冰冻。
免疫组化石蜡切片脱水用乙醇，而冰冻切片为何用蔗糖溶液，需进一步探讨
免疫组化组织细胞固定过程常见问题与原因
1、问题：组织固定不佳.
原因:(1)固定的容器过小或标本数量过多。
(2)组织取材过大、过厚。
(3)固定时间不足。
(4)固定液浓度不够或已失效。
(5)组织漂浮在固定液面（如肺脏），没有达到固定目的。
(6)固定液用量不足，与组织比例未达到5∶1以上。
2、问题：因固定原因引起的染色困难。
原因:(1)固定液选择不当。
(2)酸性固定液中固定时间过久。
3、问题：组织扭曲变形。
原因:(1)所取组织过薄。
(2)胃、肠、胆囊等空腔脏器固定时未用厚纸片敷垫，而使卷曲。
(3)组织过多而互相挤压变形。
由于标本固定不当所出现的问题，虽然有些补救办法，但所有的办法都不能得到满意的结果，而可能导致整个实验失败。最根本的是要细心操作，杜绝上述问题
免疫组织化学标记结果判断，除了鉴别肿瘤细胞阳性或阴性显色外，还必须仔细观察肿瘤细胞阳性着色程度、阳性颗粒定位和分布、阳性细胞数量、阳性标记的组织细胞形态学特征、特异性与非特异性染色，注意识别抗体交叉反应和肿瘤异常表达，并结合肿瘤本身固有的形态结构和肿瘤标记物的标记谱系，加以综合分析。因此，免疫组化标记同样具有其形态学特点，若能熟练掌握则有助于正确判断。
一、阳性标记色度特征
免疫组化标记结果的显色反应与所采用的方法和选择的底物相关。目前国内诊断免疫组化多采用免疫酶方法，通常为辣根过氧化物酶，底物为DAB，故阳性反应为黄色。肿瘤细胞阳性着色程度取决于抗原含量、分布密度和标记方法及其敏感性。一般而言，抗原含量越多，分布密度越高，标记方法越敏感，阳性结果显色则越强。根据阳性标记的显色程度分为：淡黄色，提示为弱抗原；棕黄色，为中等度抗原；棕黑色，示为强抗原。在结果判断中，后两者较有意义，可作为判断依据。而前者除考虑标本处理和方法学因素外，可能与肿瘤在分化过程中轻度异常表达，或某些恶性肿瘤细胞摄取了周围组织抗原之故，若将其作为肿瘤组织学来源的依据应十分谨慎。
此外，按其颜色的折光度，表现为暗棕色和亮棕色两种。所谓暗棕色即为灰暗的棕色反应，色质欠鲜艳而发灰，常见于某些神经内分泌肿瘤和神经鞘瘤中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S-100蛋白、神经丝蛋白和突触素等，可能与这些肿瘤细胞产生某种化学物质与底物酶或DAB作用有关。大部分标记呈亮棕色，即结果显示耀眼的棕色反应，色质较鲜艳，如上皮性肿瘤、间叶性肿瘤和淋巴瘤等大部分细胞结构和成分蛋白常为此种表现。
二、阳性标记细胞学特征
阳性标记细胞学特征是反映抗原在细胞中的定位和分布情况。决定抗原在细胞中的定位除了与肿瘤细胞本身表达部位有关外，还与组织标本固定效果、抗体的特异性和交叉反应相关。组织固定不佳除了会使抗原破坏和丢失外［1］，可造成抗原移位；抗体特异性差、纯度不够或严重交叉反应。这些都会导致背景染色加重而影响抗原在细胞中的定位。
在肿瘤诊断中阳性细胞以拟标记的肿瘤细胞为前提，阳性表达必须在细胞特定的抗原部位，若不在抗原所在部位的阳性表达和非肿瘤细胞即使是阳性也不应作为判断依据。根据抗原在肿瘤细胞中分布和阳性颗粒沉淀部位分为5种类型：
(1)胞膜型：阳性颗粒主要分布于细胞膜表面，形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。一般良性肿瘤黄色膜层较完整，厚薄均匀而规则。恶性肿瘤则深浅不一，厚薄不均，部分瘤细胞或细胞膜部分区域缺如。此类型常见于某些膜抗原，如上皮膜抗原(EMA)、上皮特异性抗原(ESA)、上皮肿瘤相关抗原(结肠癌相关抗原、肿瘤相关粘液抗原、卵巢癌抗原等)
（2）、间皮细胞抗原(HMBE-1)、淋巴细胞抗原中白细胞共同抗原(LCA)、B细胞、T细胞、粒细胞相关抗原(GAA)、Ki-1等。值得注意的是，某些膜抗原对于不同肿瘤其表达方式有一定差异，判断时应引起注意。(2)胞核型：阳性颗粒定位于细胞核。它可以均匀地分布于整个胞核，也可位于核膜下，有的呈小斑块状不规则分布，多见于增殖细胞核抗原(PCNA)、PANA、Ki-67、有丝分裂蛋白(MPM)，激素受体中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)，基因p53等。增殖细胞核抗原和某些癌基因，视肿瘤细胞良恶性和增殖情况，其染色强度和分布形式有异。良性增殖细胞多为淡黄色，颗粒细胞均匀，分布于整个细胞核；而恶性增殖细胞核深浅不一，颗粒粗细不等，部分颗粒聚积呈小块状且分布不均，当然核大小和核形态也显著异型。这些特点同样有助于良恶性肿瘤的判断，尤其对于淋巴瘤和交界性肿瘤的诊断具有重要意义。
(3)胞浆型：阳性颗粒主要分布于细胞浆。大部分抗原均属于此种类型，如细胞角蛋白、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PSAP)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、结蛋白、神经丝蛋白、肌红蛋白、α1-抗胰糜蛋白酶等中间丝及细胞成分相关蛋白多数位于细胞浆。但同一种标记在不同的肿瘤中的表现形式则有异。依据抗原在胞浆内分布形式，通常表现为弥漫和局限性两种。前者阳性颗粒弥漫而均匀地分布于整个细胞浆，包括胞体和突起。局限性是指阳性颗粒呈小斑点状或斑块状局限于细胞浆中的某一部位，核周或细胞浆的一侧等。某些神经内分泌肿瘤表达细胞角蛋白和波形蛋白。某些肌源性肿瘤中结蛋白，脑垂体肿瘤中催乳素(PRL)和生长激素(GH)常见到这种局限性分布形式。细胞浆阳性颗粒粗细与肿瘤本身类型有关，如恶性组织细胞瘤、恶性黑色素瘤和某些神经内分泌肿瘤等颗粒较粗；上皮肿瘤、肌源性肿瘤及神经鞘瘤等颗粒相对较细。
(4)微绒毛型：抗原颗粒主要分布于腺癌细胞的微绒毛，而胞浆和胞膜可以是阳性或阴性表达。这种表现形式最常见于各种腺癌，如甲状腺癌、乳腺癌、胃肠腺癌、胆道腺癌，卵巢浆液性腺癌等。其特点是阳性颗粒除靠近腔面阳性外，其余基底部可呈阴性反应。在肿瘤标记物中多见于上皮膜抗原、上皮特异性抗原、结肠癌相关抗原、肿瘤相关粘液抗原和卵巢癌抗原等。甲状腺腺癌中甲状腺球蛋白常以该形式出现。间皮细胞瘤中HMBE-1也可见微绒毛表达。但恶性肿瘤中并非所有肿瘤细胞都表达，仅见于部分腺体或部分区域的肿瘤细胞。
(5)复合型：在常规免疫组化标记中，同一种抗原可以同时表达于胞膜和胞浆、胞核和胞浆、微绒毛和胞浆，但很少发现胞膜和胞核同时表达。上皮膜抗原在腺癌中除显示膜阳性外，许多情况下胞浆也呈阳性反应。上皮特异性抗原多数为膜阳性，但在胃肠腺癌、精原细胞瘤等可显示胞浆阳性。这是由于细胞浆内有较多膜系结构，故阳性颗粒可同时定位于细胞膜和胞浆。结肠癌相关抗原在胃肠腺癌、乳腺癌相关抗原在乳腺癌和甲状腺癌、卵巢癌抗原在卵巢浆液性腺癌中，除腔面微绒毛强阳性表达外，有时胞浆也呈阳性反应。某些标记物如GAA在粒细胞和R-S细胞为膜表达，而胃肠腺癌则为胞浆表达；组织细胞抗原呈组织细胞膜阳性，某些肺癌则见于细胞浆；间皮细胞抗原对于间皮细胞表现为膜阳性，而腺癌虽也阳性，但常见于细胞浆［3］。
另一些抗原分布于细胞浆和细胞核，故细胞核和浆同时阳性。最常见的标记为S-100蛋白、黑色素瘤相关抗原(HMB45)。无论是星形细胞瘤、唾液腺肌上皮瘤、还是神经鞘瘤和黑色素瘤等S-100均可同时显示胞浆和胞核阳性。HMB45在恶性黑色素瘤中亦是如此。有时PCNA在部分Hodgkin病和个别胃肠腺癌胞浆可呈弱阳性反应，雌激素调节蛋白在乳腺癌可同时定位于胞浆和胞核。此外，组织标本固定不及时造成抗原移位，或乳腺癌中ER和PR修复不充分也可以发生核和浆同时阳性
三、阳性标记组织学特征
肿瘤免疫组化标记的组织学特点与下列因素相关：(1)肿瘤自身组织学结构，如上皮性肿瘤阳性细胞常呈团块状和腺管状，淋巴瘤多为弥漫性结构；(2)肿瘤细胞分化程度，免疫组化结构有时与HE结构并非完全一致，如低分化肿瘤可表现为不规则斑片状或局灶性阳性；(3)肿瘤细胞抗原表达的特定部位情况，如LCA、B细胞、T细胞等膜抗原在淋巴瘤中常表现为网状结构。根据肿瘤免疫组化阳性细胞的组织学特点表现为局灶型、弥漫型、片块型、网状型、腺管状型和菊团型等。
1.局灶型：阳性瘤细胞呈不规则小灶性分布。阳性细胞可多可少，排列不规则，无固定排列形式，阳性染色深浅不一。这是因为肿瘤细胞分化的不一致性之故。细胞角蛋白、上皮膜抗原在低分化鳞状细胞癌、腺癌和癌肉瘤；肌动蛋白(MSA)和结蛋白在低分化横纹肌肉瘤；NSE、神经丝蛋白、突触素在恶性神经内分泌肿瘤，低分化星形胶质细胞瘤中胶质纤维酸性蛋白，恶性黑色素瘤中S-100蛋白等均可表现为局灶性阳性。此种情况若发生在细胞结构蛋白和细胞成分蛋白则提示该肿瘤分化程度较低。某些恶性肿瘤细胞异常表达或向某一组织细胞分化也常表现为局灶性阳性，如胃肠腺癌的神经内分泌表达，平滑肌和神经鞘瘤向上皮分化等。
2.弥漫型：阳性细胞呈弥漫性分布，细胞间无连接，也可以单个细胞散在分布。淋巴造血肿瘤中Hodgkin病、部分淋巴瘤和组织细胞瘤常弥漫性分布；上皮性肿瘤中胃肠未分化癌也表现为弥漫性，但有时可见条索状结构；神经内分泌肿瘤中分化较好的肿瘤细胞可见弥漫性结构。因此，弥漫性结构常见于小圆细胞肿瘤，而且这些肿瘤细胞几乎都高度表达某种抗原，如淋巴瘤(LCA、B细胞、T细胞)，Hodgkin病(粒细胞相关抗原、Ki-1)，胃肠未分化癌癌胚抗原(CEA)、上皮膜抗原，尤文瘤中CD99等。梭形细胞肿瘤中某些短梭形细胞瘤，如肌上皮瘤、横纹肌肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤等，也可以为此结构。
3.片块型：在肿瘤免疫组化标记中，此种表现形式较常见。阳性细胞多为细胞浆表达，细胞间界限较清晰，但相互融合呈片状或团块状结构。上皮细胞源性肿瘤和某些向上皮分化的间叶源性肿瘤，如低分化鳞状细胞癌、移行细胞癌、癌肉瘤、恶性间皮瘤、滑膜肉瘤、脑膜瘤、上皮样肉瘤、恶性肌上皮瘤、上皮样平滑肌肉瘤或神经外胚层肿瘤等恶性肿瘤中的细胞角蛋白和部分上皮膜抗原；恶性黑色素瘤中HMB45和S-100蛋白；中分化神经内分泌瘤中NSE、神经丝蛋白。梭形细胞瘤亦可呈片状结构，如癌肉瘤和神经纤维瘤中波形蛋白，平滑肌肉瘤中MSA、平滑肌肌动蛋白等。
4.网状型：该型主要见于细胞密度较大的大细胞肿瘤，标记物多为膜抗原。阳性细胞膜与膜间相互紧靠，而胞核呈阴性反应，免疫组化标记显示呈网状结构。上皮膜抗原和上皮特异性抗原在低分化腺癌、肾透明细胞癌、脑膜瘤、颅咽管乳头状瘤等可呈网状结构。LCA、B细胞、T细胞在多数非Hodgkin淋巴瘤中表现为网状结构，而正常情况下则见于增生区域(如生发中心)。星形胶质细胞瘤中胶质纤维酸性蛋白，少枝胶质细胞瘤中髓鞘碱性蛋白(MBP)，恶性胸腺瘤中细胞角蛋白常为网状形式。部分恶性间皮细胞瘤中间皮细胞抗原(MCA)亦可表现为网状。几种上皮性肿瘤相关抗原除乳腺癌相关抗原在低分化乳腺癌中有这种表现形式外，其余结肠癌相关抗原、卵巢癌相关抗原则较少发现有此现象。
5.腺管型：主要见于腺癌和具有腺癌样结构的胚胎性肿瘤。标记物中细胞角蛋白、上皮膜抗原、癌胚抗原、前列腺特异抗原、前列腺酸性磷酸酶、乳腺癌相关抗原等上皮标记，且多为细胞浆表达。这是免疫组化标记中最常见的类型。胃肠低分化腺癌中有时HE很难鉴别腺样结构，但用癌胚抗原、上皮膜抗原或结肠癌相关抗原则非常容易显示出来。
6.腔缘型：阳性颗粒主要位于腺癌腔缘的微绒毛处，沿腺管腔缘表面内衬一薄层黄色颗粒，基底部多为阴性。结肠癌相关抗原在胃肠腺癌、胆囊腺癌、乳腺癌中较常表现为这种类型；卵巢癌相关抗原在卵巢浆液性腺癌亦是如此；肿瘤相关粘液抗原在许多腺癌中也显示腔缘阳性。这些标记与细胞角蛋白、癌胚抗原和上皮膜抗原的细胞定位是有一定区别的，且多见于恶性肿瘤。
7.菊团型：阳性肿瘤细胞排列呈菊团样结构，部分阳性细胞围绕血管排列。此型多见于分化较好的神经内分泌肿瘤和胶质细胞瘤等，阳性颗粒定位在细胞浆
四、阳性标记强度特征
肿瘤细胞免疫组化标记的阳性强度根据显色程度分为弱阳性、中度阳性和强阳性；也可依据阳性细胞在肿瘤细胞中所占比例大致分为：弱阳性，阳性细胞≤25%；中阳性，阳性细胞25%～50%；强阳性，阳性细胞>50%。前者主要用于肿瘤的诊断与鉴别诊断，后者则常用于肿瘤预后指标的评估。由于肿瘤细胞处于不同分化阶段和代谢状态，其抗原表达亦不可能完全一致，即使在同一张切片中不同区域抗原强弱亦不相同。正常组织细胞成分相关抗原和细胞结构抗原(如中间丝)随着肿瘤细胞低分化，抗原表达含量越低，阳性显色就越弱，阳性细胞数量也相对较少，甚至阴性表达。如上皮性肿瘤中细胞角蛋白，横纹肌肉瘤中肌红蛋白，星形胶质细胞瘤中胶质纤维酸性蛋白，神经内分泌肿瘤中NSE、神经丝蛋白等将随肿瘤低分化而丢失。然而某些肿瘤随着分化程度越低可使某种抗原高度表达，如横纹肌肉瘤和星形胶质细胞瘤随瘤细胞低分化，肌红蛋白和GFAP逐步被丢失，而获得波形蛋白高度表达。
肿瘤胚胎性抗原、肿瘤相关抗原和增殖细胞活性抗原通常随着肿瘤细胞分化越差，抗原表达越强。上皮性肿瘤中甲胎蛋白、结肠癌相关抗原、卵巢癌相关抗原、乳腺癌相关抗原、癌胚抗原等属肿瘤相关抗原。这些器官原发和转移性上皮源性肿瘤多呈阳性表达［5］。PCNA、PANA和Ki-67与细胞增殖关系非常密切，虽然阳性不能直接表示肿瘤细胞，则可间接反映这些细胞增殖情况，以此作为判断肿瘤预后的重要依据［6］。因为增殖指数越高提示恶性程度越高，预后不良。因此，在肿瘤免疫组化诊断中不必将标记阳性细胞数量作为判断指标，如果肿瘤细胞内确有阳性颗粒，且具有特定的抗原定位可视为阳性。然而，在肿瘤预后评估中尽量采用强度指标，肿瘤癌基因检测，瘤细胞增殖活性检测，激素受体PR、ER检测通常均应采用半定量进行评估。
五、非特异性着色特征
值得指出的是非特异染色、抗体交叉反应、肿瘤异常表达，肿瘤细胞摄入抗原，虽然均可干扰结果的观察和判断，但其概念则不相同。抗体交叉反应是由于该抗原决定簇同时存在于多种组织细胞，如GFAP可同时存在于星形胶质细胞和唾液腺肌上皮。S-100则更为严重，可表达于多种组织细胞。这需要我们全面了解和认识该抗体的功能和标记范围，故抗体交叉反应只要应用得当则有助于诊断。肿瘤细胞异常表达则要求我们积累丰富经验和知识，或选用多种标记去证实或排除，鉴别其真正组织来源或向某一组织细胞分化。肿瘤细胞吞噬组织抗原是由于某些恶性肿瘤细胞(如恶性组织细胞瘤、恶性黑色素瘤等)摄入周围正常组织细胞成分，虽然细胞内也存在某些抗原，但不属于瘤细胞固有成分，胞浆内抗原定位较模糊。这三种情况都具有一个共同特点，即瘤细胞内确实存在某种抗原，免疫组化呈阳性反应，而且定位于细胞某一部位，因此应该区别。
非特异性染色是指抗原无明确定位，肿瘤细胞与间质细胞，细胞与间质均为黄色，相互累及一片，色度无深浅之分。该组织细胞中可能存在拟标记抗原，也许根本缺乏该抗原。这种标记组织片不能作为判断依据。造成非特异染色的原因较多，但最常见原因为标本固定不佳，抗体质量问题或稀释度不合理，操作方法不规范等。因此，免疫组化特异性染色定位非常重要，阳性颗粒应位于肿瘤细胞膜、浆或核，阳性细胞与阴性细胞相互交杂，阳性染色强度深浅不一。这种显色强度的不均一性则是恶性肿瘤免疫组化标记的重要特征。如果缺乏细胞间的不均一性染色，即使呈阳性染色，常提示为非特异性。此外，应注意阳性肿瘤细胞与正常细胞的区别，尤其在淋巴瘤的诊断中，经验不足者常发生错误判断。但从免疫组化标记形态学特征去仔细观察则不难鉴别。组织片边缘反应和出血坏死灶周围阳性反应不能作为诊断依据。
综上所述，应强调肿瘤免疫组化诊断要以HE为基础，全面了解抗体的标记谱系和交叉反应，仔细观察阳性标记的细胞及组织学特征，认真识别肿瘤细胞异常表达与吞噬现象以及特异性与非特异染色，并进行综合分析，最后作出正确判断。
结缔组织多色法
在组织胚胎学中将结缔组织分为疏松结缔组织、致密结缔组织、网状结缔组织、软骨组织、骨组织和血液等。结缔组织结构上的特殊是细胞分散，有大量的细胞间质，后者包括纤维和基质。结缔组织染色主要用以显示或区分各种纤维成分，故又称为纤维性结缔组织多色染色法。在病理诊断中，用于判定各种组织、器官的病变程度与修复情况，以不同色调显示与区别某些非结缔组织及物质成分。
一、Mallory三色染色法
Mallory三色染色法（MCT）Mallory改良的一种结缔组织染色法，其特点是利用酸性复红、苯胺蓝、橘黄G这三种染料对结缔组织和非结缔组织进行着色。故较为常用。
[固定]用环保组织固定液固定。如果常规的甲醛固定的组织，就必须再经第二次固定，即在切片染色前可用重铬酸钾—醋酸液（重铬酸钾2.5g、醋酸5ml、蒸馏水95ml）媒染1h以上。
[试剂配制]
⑴酸性复红水溶液酸性复红0.5g,蒸馏水100ml。
⑵Mallory苯胺蓝橘黄G溶液，苯胺蓝0.5g,橘黄G 2g,磷钨酸1g，蒸馏水100ml。
先将50ml 1%磷钨酸水溶液放入烧杯内，加入苯胺蓝加热溶解。再将另50ml 10%磷钨酸水溶液放入烧杯内，加入橘黄G2g,加热溶解，冷却后分别过滤，再将两液混合即成。
[染色方法]
⑴石蜡切片5μm，环保组织透明液脱蜡至水。
⑵用Zenker液固定的组织需用0.5%碘酒溶液脱汞5-10min，经水洗后再用0.5%硫代硫酸钠水溶液脱磺。
⑶用明矾苏木素染液染色2-3min。
⑷水洗后，用0.5%盐酸乙醇分化。
⑸自来水洗返蓝为止。
⑹蒸馏水洗，入酸性复红水溶液2-5min。
⑺不经水洗，直接入Mallory苯胺蓝—橘黄G液20-40min。
⑻用95%乙醇、无水乙醇分化兼脱水。
⑼西奈山环保组织透明液透明，中性树胶封固。
[结果]胶原纤维、网状纤维，碱性颗粒呈深蓝色，粘液、软骨、淀粉样物质呈浅蓝色，纤维素、肌纤维、神经胶质、酸性颗粒呈鲜红色或粉红色，弹力纤维、红细胞、髓鞘呈橘黄色或橘红色，细胞核呈蓝黑色。
二、Masson三色染色法
Masson三色染色法（1929年） 由Mallory(1938年)改造。此法最好用西奈山环保组织固定液固定，10%甲醛液固定略差，若再用重铬酸钾液处理后也能获得较好的结果。
适用于脑垂体、上皮、甲状腺、神经的正常和肿瘤组织。
〖显示目的〗核、嗜银颗粒、神经胶质纤维、胶原、角质、细胞间纤维等。
〖试剂配制〗
⑴Regaud苏木素染液苏木素1g,95% 乙醇10ml,甘油10ml,蒸馏水80ml。
⑵丽春红酸性复红液丽春红0.7g，酸性复红0.3g,蒸馏水99ml,冰醋酸1ml.
⑶醋酸苯胺蓝液苯胺蓝2g, 蒸馏水98ml,醋酸2ml。
⑷苦味酸乙醇液苦味酸（约7%）在95%乙醇中的饱和液20ml，再加95%乙醇10ml。
〖染色方法〗
⑴切片西奈山环保组织透明液脱蜡至水，如用Zenker液固定，应进行除汞处理。
⑵Regaud苏木素液染5min。
⑶95%乙醇中洗2次。
⑷在苦味酸乙醇液中分色。
⑸在流水中洗，蒸馏水洗。
⑹丽春红酸性复红液中染5min.
⑺蒸馏水洗。
⑻1%磷钼酸中染5min.
⑼不经水洗，直接入醋酸苯胺蓝液中5min。
⑽1%醋酸处理1min。
⑾95%乙醇脱水，无水乙醇脱水多次。
⑿西奈山环保组织透明液透明，中性树胶封固。
[结果]胶原纤维呈蓝色，弹力纤维棕色，肌纤维、纤维素、红细胞呈红色，胞核呈黑蓝色。
三、Masson三色改良法
[固定]西奈山环保组织固定液固定效果最好。若用单纯甲醛固定，切片应在3%升汞或苦味酸乙醇液中放置1h，则有加强染色的作用。
[试剂配制]
⑴地衣红染液地衣红1g,80%乙醇99ml，盐酸1 ml。
⑵丽春红品红液丽春红0.8g，酸性品红0.4g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml。
⑶亮绿染液亮绿2g,冰醋酸2ml，蒸馏水98ml。
⑷冰醋酸水溶液冰醋液0.2ml，蒸馏水100ml。
⑸磷钼酸水溶液磷钼酸1g，蒸馏水100ml。
[染色方法]
⑴石蜡切片厚3-5μm，西奈山环保组织透明液脱蜡至水，蒸馏水洗。
⑵入地衣红染色液30-60min。
⑶蒸馏水洗2-3min。
⑷入Harris明矾苏木素液2-5min。
⑸0.5%盐酸分化，水洗显蓝，蒸馏水洗。
⑹入丽春红、酸性复红液5-10min。
⑺入冰醋酸水溶液0.5-1min，蒸馏水洗。
⑻磷钼酸水溶液3-5min至胶原纤维呈淡红色或无色，肌纤维为红色。
⑼入冰醋水溶液中30s。
⑽入亮绿染色液中3-5min。
⑾入冰醋酸水溶液中30s。
⑿95%及无水乙醇脱水。
⒀西奈山环保组织透明液透明，中性树胶封固。
[结果]胶原纤维呈绿色，弹性纤维呈棕色至深棕色，肌纤维呈红色，纤维素呈红色，红细胞呈黄色，胞核呈蓝黑色。
[说明]
⑴各步分色时应镜检控制颜色，勿使醋酸分化过度。
⑵亮绿可用苯胺蓝代替。
整切片，最长为数小时。
5.浸蜡与包埋用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和环保组织透明液的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。
6.切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。
7.贴片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
8.切片脱蜡及水化干燥后的切片需脱蜡及水化才能在水溶性染液中进行染色。用西奈山环保组织透明液脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水。如果染料配制于酒精中，则将切片移至与酒精近似浓度时，即可染色。
9.染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色以便于观察。未经染色的细胞组织其折光率相似，不易辨认。经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。染色剂种类繁多，应根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法，还要注意选用适宜的固定剂才能取得满意的结果。经典的苏木精（Hematoxylin）和伊红（曙红，Eosin）染色法是组织学标本及病理切片标本的常规染色，简称HE染色。经HE染色后，细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。由于苏木精是带阳离子的染料，染液呈碱性，核内染色质及胞质内核糖体等物质对这种染料有亲和性，称嗜碱性；而带阴离子的染料伊红配制的染液呈酸性，对这种染料的亲和性，称嗜酸性。有时不同的组织结构还需要用特殊的染料及染色方法加以显示，称特殊染色。有些细胞组织经硝酸银浸润后，可使溶液中银离子还原成金属银或银粒附着在细胞组织上，呈棕黑色，这种性质称亲银性，而有些细胞组织本身不能使硝酸银的银离子还原成金属银，还需加还原剂才能将银离子还原，称嗜银性。
10.切片脱水、透明和封片染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。环保组织透明液透明后，迅速擦去材料周围多余液体，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在光镜下可长期反复观察。注意有些染料需特定厂家生产的产品。根据各种染色方法、组织类别及切片厚度，掌握适宜的染色时间，才能达到较好的染色效果。
石蜡切片
组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织***，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
石蜡切片制作基本技术石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
1.取材应根据要求选取材料来源及部位。例如植物细胞有丝分裂多选取洋葱根尖，细胞分裂快又便于切取；猪的肝小叶边界清晰明确；耳蜗以豚鼠的内耳易于定位和剥离。材料必须新鲜，搁置时间过久则产生蛋白质分解变性，导致细胞自溶及细菌的滋生，而不能反映组织活体时的形态结构。
2.固定用适当的化学药液——固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。固定能使组织硬化，有利于切片的进行，而且也有媒浸作用，有利于组织着色。固定液的种类很多，其对组织的硬化收缩程度以及组织内蛋白质、脂肪、糖类等物质的作用各不相同。例如纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素。固定液可分为单一固定液及混合固定液。前者有甲醛（蚁醛、福尔马林）、酒精、醋酸或冰醋酸、升汞、锇酸（四氧化锇）、重铬酸钾及苦味酸等，单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。因此，应根据所要显示的内容来选择适宜的固定液。10％福尔马林（4％甲醛）或10％磷酸缓冲福尔马林是病理切片常规使用的固定液，因有毒，现医院多使用西奈山环保组织固定液，不仅适用于常规HE（苏木精-伊红）染色，还可以用于组织学有关的其他技术的切片染色。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。
3.洗涤与脱水固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗；使用含有苦味酸的固定液固定的则需用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。固定后或洗涤后的组织内充满水分，如不除去水分就无法进行以后的透明、浸蜡与包埋，因为透明剂多数是苯类，苯类和石蜡均不能与水相融合，水分不脱尽，苯类不能浸入。酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30％或50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1～数小时，如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。
4.透明纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯西奈山环保组织透明剂中浸渍。透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完
制作石蜡切片的常见问题及处理
2012-11-27 17:58:12 来源：生物秀 评论：0 我要评论
摘要：文章总结了制作石蜡切片过程中的常见问题，并分析其产生的原因和解决方法。 关键词：石蜡切片；问题；处理 The Common Problems of and Solutions to M aking Paraffin Section JIANG Hong (Qianjiang College，Hangzhou Normal University，Hangzhou，Zhejiang 310012，China) Abstract：This paper summarized the common problems in the process of making parafi n section，analysed their causesand provided solutions． Key words：Parafi n section；problem ；solution…
石蜡切片是组织学和病理学的主要实验方法， 也是临床中观察病理变化的重要手段，为教学、科研 和临床诊断做出了卓越贡献。实践发现，切片制作 过程中常常由于多方面的原因遇到困难，甚至导致 制片失败。本文将对制作石蜡切片过程中的常见问 题和处理方法作重点介绍。
1 切片不成带：
① 切片刀不够锋利。
② 切片刀与蜡 块的角度不当。
③蜡块四周留蜡边太少。
④石蜡硬度过大，黏度不够。
解决方法：
①重新磨刀。
②调整切片刀的角度。
③ 可重新包埋或将蜡块四周熔化，再放人包埋框中补蜡，修理蜡块时组织块周围保留的石蜡以2 mm左右为宜。
④ 蜡块过硬可适当加些蜂蜡，或更换熔点较低的石蜡重新包埋。⑤ 将蜡块放入冰箱内延长冰冻时间，然后迅速切片。
2 切片弯曲
常见原因：
①组织成分及形状不规则。
②蜡块上下或左右两边不平行。
③ 蜡块与切片刀刀口不平行。
④ 切片刀各处的锋利程度不一致。
解决方法：
① 修整组织块时，注意修切整齐，切成方形或矩形，尽量不要切成三角形 。
② 将蜡块四边反复修平对称。
③ 调节蜡块夹持器，使其与切片刀平行。
④ 移动切片刀，更换刀口位置。
⑤ 使用负离子发生器直吹切片处可防切片卷曲 。
免疫学实验技术论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html
3 切片上出现裂纹
常见原因：
① 切片刀上有小缺口，或刀口不平整。
② 刀口上粘附有细微纤维(如毛发、纸或布丝等物)。
③ 组织过硬变脆(如凝血块、胶冻样物质、囊腺瘤、甲状腺、腺瘤等) 。
④ 组织中可能含有较硬之物质，如固定液之结晶石灰质。
⑤ 裱片的水温太高。⑥包埋时石蜡冻结太慢。
解决方法：
①切片刀某处有缺口，可调换刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口过多且不平整，可先将刀锋垂直在磨刀石上轻轻磨数次，然后按常规磨刀。
② 擦净刀口。
③ 适当减少脱水、透明、浸蜡时间。
④组织中硬性物质太多，则不宜用。
⑤ 裱片的水温以45℃左右为宜。
⑥ 包埋时待蜡块周围凝结一层，即放入冷水中。
