2022.05.21 刘国文分享“IFN-γ通过促进YAP相分离诱导肿瘤抗-PD1免疫治疗耐药”的故事
大家好，今天给大家分享的这篇文章是由华中科技大学的团队在2021年3月发表在Molecular Cell上的论文：Interferon-ginduces tumor resistance to anti-PD-1immunotherapy by promoting YAP phaseseparation
先来给大家介绍一下本篇文章的背景，PD-1（程序性死亡受体1），是一种重要的免疫抑制分子，同时PD-1也是免疫检查点，主要通过两种机制防止自身免疫，一方面，它促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡（程序性细胞死亡）；另一方面，它减少了调节性T细胞（抗炎，抑制性T细胞）的细胞凋亡。研究发现PD1的配体PD-L1在几种癌症中高度表达，并且PD1在癌症免疫逃避中的作用已得到很好的证实。目前已经开发了许多靶向PD-1受体的癌症免疫治疗剂，如纳武单抗、派姆单抗等，这两种单抗都被批准用于黑色素瘤的治疗。
然而，在实体肿瘤中普遍存在免疫治疗耐药的情况。在此过程中，IFN-γ是扮演着非常重要的角色，阻断PD-1/PD-L1能够激活T细胞，T细胞分泌IFN-γ，IFN-γ能够通过PD-L1依赖与非依赖的方式介导耐药。因此，全面了解IFN-γ信号是如何帮助肿瘤抵抗免疫治疗对于肿瘤的临床治疗至关重要。
YAP能够直接或间接调节效应T细胞功能介导肿瘤免疫抑制。同时YAP也可以促进许多细胞因子、趋化因子和细胞外基质(ECM)分子的表达，这些分子招募多种细胞亚型，包括肿瘤相关的巨噬细胞，骨髓来源的抑制细胞，调节细胞T细胞以及肿瘤相关成纤维细胞，最终建立免疫抑制的微环境；此外，将抗PD-1治疗与YAP抑制剂维替泊芬联合能够明显抑制肿瘤生长，但YAP在抗PD-1治疗中的作用及调节机制尚不清楚。
这篇文章的主要内容可以分为一下几点：①在抗PD-1治疗后γ干扰素（IFN-γ）能够促进肿瘤细胞中YAP的相分离；②YAP凝聚体是通过卷曲螺旋结构域所介导的疏水相互作用形成的；③YAP凝聚体形成一个转录中心，促进靶基因的表达；④YAP的相分离能够介导抗PD-1免疫治疗耐药。
为了探究抗PD-1治疗过程中YAP的作用，作者首先构建了小鼠肺腺癌的模型；为了进一步验证治疗效果，作者比较了对照组和抗PD-1治疗组的肿瘤大小，结果发现两组并没有明显差异；之后为了监测肿瘤的生长情况，作者将肺腺癌模型中分离出来的肿瘤细胞（TDCL）皮下接种到C57B/6小鼠体内，结果发现在抗PD-1治疗后的第12-18天，接种TDCL的小鼠肿瘤生长受到明显抑制，但在第21天肿瘤生长恢复正常，表明已经发展到耐药阶段；为了进一步验证是否形成耐药细胞，作者通过流式分析比较了治疗应答阶段与耐药阶段肿瘤细胞内细胞毒性T细胞（CTLs）和CD8＋T细胞的含量，结果表明应答阶段的肿瘤细胞内CD8＋T细胞与CTLs含量明显增加，而耐药阶段的CD8＋T细胞与CTLs数量与对照组相比没有明显差异，这表明T细胞在抗PD-1治疗的初期是处于激活状态的，但最终对抗PD-1治疗不应答。
随后作者通过免疫荧光（IF）分别检测应答阶段和耐药阶段TDCL细胞内YAP的定位，结果发现当细胞处于应答阶段时，YAP位于细胞质中，呈明亮紧密连接；当细胞处于耐药阶段时，YAP转移到了细胞核内，并且在免疫细胞浸润部位呈现点状分布，相反，在非浸润部位YAP仍然处于细胞质中。
为了探究抗pd-1/PD-L1治疗后是否在其他肿瘤类型中也会形成YAP点状聚集，作者利用免疫荧光检测了小鼠肾细胞癌(RCC)移植BALB/ c模型的肿瘤细胞中YAP的分布，结果与之前相一致；随后为了表征YAP斑点的性质，作者通过三维重建发现这些点状聚集定位在常染色质上发挥转录活性。
由于YAP核点状分布仅发生在肿瘤CD8+T细胞浸润区域，提示YAP激活可能需要来自免疫系统的信号。同时，在免疫治疗过程中，白介素-12（IL-12）和IFN-γ通常在肿瘤微环境中上调，因此作者分别使用IL-12和IFN-γ刺激TDCL细胞，结果表明只有IFN-γ能够引起YAP的核点状聚集，同时YAP的蛋白含量也明显升高；之后作者通过不同浓度的IFN-γ以及不同时间处理TDCL细胞和Lewis肺癌(LLC)细胞系，结果表明YAP的核点状分布呈现浓度和时间依赖性。
随后，为了排除IF的影响，作者利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术将YAP用内源性的mEGFP标记，与此前一致，在IFN-γ的刺激下，YAP转移到细胞核当中并形成点状聚集；为了进一步探究IFN-γ信号是否是形成YAP核点状聚集的必要因素，作者利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建了IFNGR1敲除细胞系，在IFN-γ刺激与抗PD-1治疗的情况下，YAP都不会出现核点状聚集，这些结果进一步说明IFN-γ信号是YAP形成核点状聚集所必需的。
近年来的研究表明，相分离在转录控制中起着关键作用。这促使作者进一步探究YAP形成的核点状聚集是否是相分离凝聚体。作者首先利用PONDR网站预测表明YAP在N端和C端分别拥有一段内在无序区（IDR），因此作者利用mEGFP分别标记YAP的N端和C端IDR并在体外进行纯化。之后分别将N-IDR和C-IDR加入到25%聚乙二醇6000中，发现它们都出现了明显的点状聚集，当1:2稀释聚乙二醇后，点状聚集明显减少，说明YAP的相分离过程具有可逆性；之后作者利用荧光漂白恢复试验（FRAP）发现光漂白后，斑点可在数秒内融合并恢复荧光，表明YAP凝聚体具有一定的流动性；此外，通过比较发现，C-IDR在15%和10%的聚乙二醇中点状聚集数目多于N-IDR，表明C-IDR的相分离能力优于N-IDR。
为了确定两个IDR是否能在细胞中分别形成凝聚物，作者通过optoDroplets实验发现只有N端的IDR能够在细胞内发生相分离，同时通过FRAP和融合实验表明C-IDR具有液滴性质。这些结果表明只有YAP的C-IDR能够在细胞内形成生物凝聚体。
由于IFN-γ的YAP点状结构是通过增加YAP核定位而形成的，因此作者推测表达野生型(WT)YAP或激活型YAP (S127A)可以导致相的形成。因此作者将WTYAP或YAPS127A分别与mEGFP融合，并在AD293和TDCL细胞中表达。与预期一致，YAPS127A转染组比YAP组核点数量更多，核点大小更大；FRAP实验同样表明YAPS127A凝聚物具有液滴性质；之后为了进一步验证YAP在细胞内的相分离现象，作者利用1,6己二醇分别处理AD293细胞和TDCL细胞，发现1,6己二醇处理后破坏了内源性YAP和过表达mEGFP-YAPS127A点状斑点。
作者通过进一步的剖析发现YAP的C-IDR包含一段卷曲螺旋（CC）结构域和转录激活结构域，为了评估CC和TAD在YAP相分离中的作用，作者利用Gal4-UASLuciferase(Luc)法精确地绘制了TAD区域，发现最小区域从450 ~ 504的转录活性相当于全长TAD，因此作者分别将CC结构域、短IDR（sIDR）以及短TAD（sTAD）从mEGFP-YAPS127A中截去，结果表明截短CC结构域后YAPS127A的点状聚集完全消失，截短sIDR后点状聚集减少，截短sTAD后没有变化，这些结果表明，YAP的相分离需要CC和sIDR；optoDroplets实验也表明CC结构域能够在细胞内发生相分离；此外，这三种截短都减少了YAP靶基因的表达。
为了进一步探究C结构域中驱动相分离发生的位点，作者首先通过分析发现四个亮氨酸残基（L308、L311、L318和L325）占据了疏水位点，因此作者分别突变了四个位点以及同时突变四个位点发现分别突变四个位点后点状聚集明显减少，而将四个位点同时突变后，相分离现象完全消失；通过体外试验也同样证明了这一点。总之，YAP的相分离是由CC结构域以及sIDR所介导的。
之前的报道中表明TEAD、EP300、MED1、和BRD4能与YAP发生相互作用，因此作者利用IF发现在AD293细胞以及TDCL细胞中YAP都能够与这些蛋白共定位；为了进一步探究TEAD4如何与YAP发生相分离，作者通过PONDR网站预测TEAD的IDR，并将该段IDR在体外纯化出来。
结果表明TEAD4-IDR本身在体外无法发生相分离，但可以与YAP的C-IDR发生相分离；此外，TEAD4含有一段YAP结合结构域（YBD），作者将YBD与TEAD的IDR分别带上mCherry标签，转入细胞内发现两段都无法在细胞内发生相分离，但是在YAPS127A存在的情况下能够发生相分离，说明YAP可能具有脚手架的作用。
同时，作者也分别对P300的IDR进行验证，结果表明只有EP300-C-IDR能够与YAPS127A发生相分离。
之后作者进一步研究了YAP凝聚物的功能。TEAD4作为一种转录因子，识别并结合到目标增强子和启动子区域；EP300作为乙酰转移酶能够乙酰化组蛋白H3赖氨酸27，打开染色质进行转录；MED1可以招募RNA聚合酶进行转录起始。因此作者推测YAP凝聚体的功能是转录中心。为了验证这一点，作者通过原位杂交（Fish）技术发现靶基因Cyr61和 Myc与YAP凝聚体存在共定位；为了检验EP300是否在液滴内改变染色质，作者评估了H3K27ac，结果表明在许多YAP凝聚物中，H3K27ac水平较邻近区域显著上调。
此前，有报道称Myc受超级增强子调控，超级增强子在H3K27乙酰化过程中被密集修饰，为了探究YAP相分离是否会影它调控区域的H3K27ac水平，作者通过染色质免疫沉淀（Chip）qPCR技术YAP相分离的缺失会降低Myc的H3K27ac修饰；之后，作者检测了YAP靶基因的表达，结果表明在YAP相分离缺失的情况下YAP靶基因的表达会显著下调。
为了探究YAP相分离在细胞内的功能，作者利用CRISPR-Cas9技术构建了YAP和TAZ敲除TDCL细胞系，之后回补了YAP、YAP△CC以及YAP4LE。通过克隆形成和软琼脂克隆形成试验表明YAP相分离的缺失会削弱肿瘤细胞的生长；为了在体内进一步YAP相分离的功能，作者将等量的YAP、YAP△CC以及YAP4LE细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠Gag2-/-小鼠体内，结果表明，YAP相分离的缺失抑制了肿瘤的生长。
为了评估YAP相分离的免疫功能，作者比较了WT和Rag2-/-小鼠中完整YAP和YAP 相分离缺陷细胞系的肿瘤生长情况，结果表明相分离的缺失导致肿瘤细胞对免疫调控更加敏感，这也表现在YAP相分离缺失的细胞中细胞毒性T细胞含量显著升高；随后，作者推测YAP相分离缺陷可使癌细胞对抗PD-1治疗增敏，因此，作者将YAP、YAP△CC和YAP4LE细胞移植到C57B/6小鼠体内，用抗pd-1或免疫球蛋白G (IgG)处理，结果表明与IgG组相比，抗PD-1治疗进一步缩小了YAP△CC和YAP4LE组的肿瘤大小；此外，IF和HE染色结果显示，与YAP细胞系相比，YAP相分离缺陷肿瘤切片显示CD8+细胞浸润和坏死增加。
为了进一步确认YAP相分离介导的免疫治疗耐药是否由ISGs引起，作者通过RNA-seq和qPCR比较了YAP和YAP4LE细胞的转录谱，结果表明经典ISGs不会被YAP相分离所影响；为了探索YAP相分离是否会影响IFN-g-STAT1-IRF1级联反应，作者通过WB检测了磷酸化STAT1和IRF1表达水平，结果表明蛋白表达水平没有明显变化，因此，作者认为YAP凝聚介导的免疫治疗适应性耐药平行于IFN-g-STAT1-IRF1轴。
有趣的是，许多已知的YAP靶基因出现明显下调，这些基因同样在IFN-γ刺激下应答；此外，CD155下降最多，说明CD155是YAP的直接靶基因，荧光素酶报告实验显示破坏YAP相分离或敲除YAP会降低Luc表达，表明CD155是其直接靶点并由YAP相分离驱动。
为了明确CD155在aPD-1免疫治疗TDCL细胞中的作用，作者将CD155RNAi细胞系皮下接种到C57B/6小鼠体内，并用抗pd -1或IgG进行处理，结果表明，抗PD-1治疗进一步减小了RNAi组的肿瘤大小；同时肿瘤切片的IF和HE分析显示，两种RNAi系中CD8+细胞浸润增多，坏死增多，表明CD155的缺失会导致肿瘤细胞对抗PD-1治疗更加敏感。
作者认为有人会认为抗PD-1治疗敏感性的增加是由于肿瘤体积的减小，因此作者在接种时选择能够使最初肿瘤体积一致的细胞数量，最终的实验结果与之前相一致。
为了评估临床中的YAP活性和抗pd-1治疗结果，作者分析了纳武单抗免疫治疗期间黑色素瘤患者的RNA-seq数据，结果表明较高的YAP转录活性与较差的临床反应相关。
以上就是本研究的主要内容，这篇文章的主要内容讲述的是抗PD-1治疗会激活CTLs，激活的CTLs会释放IFN-γ，IFN-γ能够促进YAP入核并形成相分离液滴。这些YAP凝聚物形成一个转录中心，促进靶基因的表达，最终导致肿瘤细胞的抗PD-1耐药。
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