黄灿华教授 实验室

2022.06.16 明慧分享“外泌体内容物DEK”的故事

大家好,今天和大家分享一篇今年三月份发表的文章《Exosomal DEK removes chemoradiotherapyresistance by triggering quiescence exit of breast cancer》,这篇文章描述了外泌体内容物DEK可以通过使乳腺癌干细胞退出静息状态,从而逆转放化疗耐药的分子机制。

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文章的通讯作者是浙江大学的杨卫军教授,他主要致力于细胞生物学、生物化学、海洋生物学的研究,近几年在国际主流刊物上发表了数篇文章。

我们都知道,放化疗可以杀伤大部分的肿瘤细胞,但难以达到根治的效果。一个重要原因是治疗后一部分的肿瘤细胞治疗耐受,在治疗结束后可重新获得增殖和转移的能力。针对这一部分治疗耐受的肿瘤细胞,深入研究其治疗耐受的机制,对于提高难治性肿瘤的治疗效果具有重要意义。

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越来越多的研究表明治疗耐受的肿瘤细胞可能是一种处于休眠状态的肿瘤干细胞,它们通过调整细胞周期使自己进入休眠的状态来抵抗治疗,在治疗结束后可退出休眠的状态,重新获得增殖的能力。

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这篇文章的作者长期从事肿瘤休眠研究。在自然界中,也存在休眠的现象,其中卤虫由于其结构简单,生殖周期短,被作为研究肿瘤休眠的模式生物。卤虫相对于大多数其他生物具有更好的抗逆性,可以在高辐射高盐的环境中生存,在环境适宜的条件下可以通过卵胎生迅速生产幼虫;而遇到恶劣环境时,卤虫可以产生休眠囊泡,通过停止增殖对抗恶劣环境,有研究报道,这种囊泡可以1万年都保持活力。作者在前期研究中通过研究卤虫休眠前后的表观遗传改变,发现了SETD4可以通过调控组蛋白H4K20me3修饰促进肿瘤休眠;而核蛋白DEK促进了肿瘤休眠的终止。

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由于卤虫的休眠与肿瘤细胞的休眠具有一定的联系,作者在模式动物中研究后,又在肿瘤休眠细胞中进行进一步的验证。通过流式分选,筛选出了在治疗过程中增殖停滞,并且停止治疗后能够重新增殖的肿瘤休眠细胞。在这一肿瘤模型中,作者发现SETD4通过表观遗传调控H4K20me3修饰促进肿瘤休眠,进而导致了肿瘤的化疗耐药。

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而参与休眠终止的另外一个蛋白,DEK,最初是在急性髓系白血病患者中作为一种融合蛋白被发现,越来越多研究关注到DEK多种难治性肿瘤中高表达,并且可以通过外泌体的形式分泌到胞外,通过调控异染色质的完整性发挥作用。

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H4K20me3 是异染色质常见的一种组蛋白修饰。当H4K20me3增多时,染色质排布紧密,相关蛋白编码基因发生沉默。

这一篇文献详细介绍了SETD4DEK在肿瘤细胞中表达优势的不同对于肿瘤细胞休眠的维持与重新激活起着至关重要的作用,其中Mycp53发挥了重要作用。此外,作者还研究了DEK可通过外泌体形式分泌到胞外调控肿瘤细胞退出休眠,对于休眠肿瘤的临床治疗具有重要的指导意义。

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这是整篇文章的大纲。

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首先,为了获得治疗耐受的肿瘤细胞,作者利用两种鼠源(4T1EMT6)和一种人源(MCF7)的乳腺癌细胞分别构建了CDX肿瘤模型,肿瘤体积达到500 mm3时,被取材剪碎并用胰酶消化成细胞悬液,随后用紫杉醇和5-Fu处理两周,并且在化疗药物处理的第7天和第14天给予X-ray照射。用台盼蓝标记死细胞并利用死细胞清除试剂清除死细胞,剩下的细胞即为治疗耐受的肿瘤细胞 (Therapy-resistant cells)。这些治疗耐受的肿瘤细胞在撤除化疗药物之后又可以重新被激活,恢复增殖能力。

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作者发现,这些治疗耐受细胞的增殖能力减弱,具体表现在Ki67、磷酸化的H3S10PCNA表达水平降低。并且在化疗药物处理的情况下,这些治疗耐受细胞可以一直维持几乎不增殖的状态。表明治疗耐受细胞可能处于休眠状态。

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一旦撤除化疗药物,这些治疗耐受细胞又可以重新被激活。表现为增殖标志物的蛋白表达水平增多,3D培养成球能力和皮下成瘤能力增强。

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但是不管是这些细胞是处于休眠还是激活的状态,它们都保持着明显的干性特征。具体表现为与普通肿瘤细胞相比,这些细胞均维持着高表达水平的ALDH1CD44和低表达水平的CD24

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小结:从三种乳腺癌CDX模型中,成功分离出了放化疗耐受的肿瘤干细胞(therapy-resistant CSCs),在化疗药物处理的情况下,这些治疗耐受细胞维持休眠状态(qCSCs),一旦撤除化疗药物,静息态的CSCs又可以重新被激活(aCSCs),获得增殖能力。

作者首先检测了DEKSETD4蛋白的表达水平。发现在细胞和组织水平,休眠细胞中SETD4高表达,DEK低表达;而激活后SETD4低表达,DEK高表达。

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那么DEK是否发挥了激活休眠CSCs的功能呢?于是,作者构建了内源性DEK敲降模型。发现在敲降DEK后,增殖标志物的表达水平明显降低,SETD4的表达水平明显升高。成球能力也受到了明显的抑制。

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为了进一步明确DEK激活休眠CSCs的功能,作者构建了带GFP绿色荧光标签的DEK重组质粒,包括野生型DEK与核定位序列缺失突变型DEKDEK作为一种高度保守的核蛋白,入核后可与染色质结合,参与表观遗传或转录后修饰调节。从免疫荧光和WB的实验结果验证了核定位序列缺失突变型的DEK不能进入细胞核发挥作用。

此外,在内源性敲降DEK后,只有回补野生型的DEK才可以明显上调增殖marker的表达水平,并下调SETD4的表达水平。3D培养成球能力也得到了回复。

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但是敲降或回补DEK都不会影响CSC的干性。以上结果说明,内源性的SETD4DEK对于休眠的维持与重新激活起着至关重要的作用。

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研究报道,除了在细胞内发挥作用,DEK还可以被分泌到胞外,作用于受体细胞后发挥功能。为了检测外源性的DEK是否同样可以激活休眠的CSCs,作者又外源性过表达DEK蛋白,发现外源性过表达野生型DEK蛋白 20h后增殖marker的表达水平明显上调,SETD4的表达水平明显下调,但CSCs的干性marker未发生明显改变。

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并且外源性过表达野生型DEK蛋白30h后,化疗药物处理可以杀死绝大多数肿瘤细胞,说明外源性的DEK也可以激活休眠的CSCs,并且可以逆转耐药。

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小结:DEK可激活休眠的CSCs,并且可以逆转CSCs耐药。

DEK激活休眠CSCs的具体分子机制是什么呢?

DEK作为一种DNA结合蛋白,在调控染色质生物学功能中发挥着重要的作用。于是,作者将外源性DEK激活的CSCs进行CHIP-Seq,发现DEK23对人类染色体结合的位置主要集中在启动子区域,进一步的基序分析发现DEK与一些转录因子相结合,功能富集分析发现DEK 结合的蛋白主要涉及蛋白质结合、胞内信号转导和细胞生长等生物学功能。

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那么DEK在激活休眠CSCs的过程中是如何调节染色质结构的呢?透射电镜(TEM)观察到外源性过表达野生型DEK蛋白后,紧密排布的异染色质明显减少。免疫荧光和WB结果均表明,异染色质的markerH4K20me3HP1-α)表达水平减少,常染色质markerH3K9ac)表达水平反而增多此外,敲降DEK后,H4K20me3HP1-α表达水平增多,H3K9ac表达水平减少。进一步回补DEK后,这些蛋白的表达水平又得到了回复。说明DEK可能通过调控异染色质的完整性来激活休眠的CSCs,这与背景中介绍的机制一致。

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为了进一步分析DEK处理后染色质结构的变化,作者将休眠的CSCs和激活的CSCs分别进行了ATAC-Seq分析,结果发现激活的CSCs中信号峰更高,说明激活的CSCs具有更高的染色质可及性和基因活性。

功能富集分析发现两种不同状态的CSCs表现出不同的信号峰,而激活的CSCs中上调的信号峰主要与胞内信号激活、加工以及代谢相关。

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此外,CHIP-Seq结果表明激活的CSCs中,DEKSETD4TP53MYC的启动子区域均有富集。并且在SETD4TP53的信号峰要明显弱于在MYC基因。这可能是因为在休眠CSCs激活的过程中,DEK与启动子区域结合从而上调MYC的表达,同时下调SETD4TP53的表达。

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小结:DEK通过直接与染色质结合,提高基因组的可及性,从而激活休眠的CSCs

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于是作者利用RNA-Seq分析了休眠CSCs和激活CSCs中差异基因的表达情况。发现在激活的CSCs中,有2119个基因上调,3338个基因下调,并且这些上调的基因主要涉及细胞周期G0-G1的转变,细胞增殖或代谢过程,下调的基因主要与细胞休眠相关。

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基因集富集分析发现上调的基因主要涉及DNA复制、代谢、氧化磷酸化和E2FMYC的靶点,下调的基因主要涉及缺氧、炎症反应、EMTIL6-JAK-STAT3信号通路和TP53信号通路。

此外,在休眠的CSCs被激活后,MYC靶向的25个基因表达上调,而p53信号通路相关的30个基因表达下调。WB结果也显示DEK处理后,P53P21PUMA的蛋白表达水平明显下调,而MYC明显上调。敲降DEK后,P53P21PUMA的蛋白表达水平明显上调,而MYC明显下调。回补DEK后,这些蛋白的表达水平又可以得到回复。

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小结:DEK作用于染色质后,通过上调MYC靶基因,同时下调P53信号通路相关基因的表达来激活休眠的CSCs

作者基本确定了DEK激活休眠CSCs的分子机制。接下来作者又发现有文献报道DEK可以以外泌体的形式被分泌到胞外,作用于受体细胞后发挥功能。并且前期的研究也发现外泌体处理可以促进休眠CSCs的激活。那外泌体来源的DEK是否以同样的方式激活休眠的CSCs呢?

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于是,作者提取了3种乳腺癌细胞分泌的外泌体,并对其进行了表征。发现外泌体中富含DEK。与外源性补充DEK蛋白的效果一样,富含DEK的外泌体同样可以激活休眠的CSCs,具体表现为上调增殖marker的表达水平,同时下调SETD4的表达水平。此外,用富含DEK的外泌体处理休眠CSCs 30h后,化疗药物几乎可以完全杀死肿瘤细胞。


到底是外泌体中的DEK还是其他成分发挥了作用呢?于是作者又提取了外源性过表达DEK后细胞分泌的外泌体,随后根据粒径大小分选出粒径在50-200nm的外泌体,再根据是否有GFP绿色荧光分选出含外源性过表达DEK的外泌体。并对其进行了表征。WB结果中我们可以看见外泌体中富含带有GFP标签的外源性DEK蛋白,而非内源性的DEK

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进一步实验证明,只有富含野生型DEK的外泌体可以进入细胞核,可以激活休眠的CSCs,并且,在补充富含野生型DEK的外泌体30h后,化疗药物可以完全杀伤肿瘤细胞,说明富含DEK的外泌体可以激活治疗耐受的休眠CSCs,从而逆转耐药。

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分子机制上,富含DEK的外泌体处理后,紧密排布的异染色质也出现了明显的减少,异染色质marker的表达水平下调,常染色质marker的表达水平上调,MYC靶基因的表达水平上调,P53信号通路相关基因的表达水平下调。

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小结:外泌体来源的DEK同样可以通过改变染色质构想,上调MYC靶基因,同时下调P53信号通路相关基因的表达,从而激活静息态的CSCs.

做到这里,作者在体外已经基本确定了DEK激活休眠CSCs的分子机制。那DEK在体内是否可以激活休眠的CSCs,激活后对肿瘤的发生发展又会有着怎样的影响?

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于是作者构建了CDX肿瘤模型,在肿瘤进展的不同阶段,提取了荷瘤小鼠血液中的外泌体。发现在肿瘤进展早期外泌体内的DEK含量相对较低,进展期明显升高,放射治疗后降低,复发阶段又有明显的升高。表明血液外泌体内的DEK与肿瘤进展的过程密切相关,并且可以激活休眠的CSCs

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为了进一步明确外泌体内的DEK在体内是否可以激活休眠的CSCs,作者通过尾静脉给CDX小鼠注射了外泌体,发现含有DEK的外泌体在尾静脉注射24h后在血液中明显富集,7天后仍然维持一定的水平。免疫荧光的实验结果也发现尾静脉注射24h后富含野生型DEK的外泌体可以进入细胞核内,说明外泌体在血液内运输的稳定性,不易被免疫系统清除。作者还发现,尾静脉注射24h后,休眠的CSCs明显减少,7天后又显著增加。以上结果表明,EDK在体内可以激活休眠的CSCs

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DEK激活休眠的CSCs后,对肿瘤的发生发展又会有着怎样的影响呢?作者发现,富含野生型DEK的外泌体处理组,肿瘤体积明显增大,肺转移数量增多,休眠的CSCs增多(28天),生存期明显缩短。

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除此之外,作者还评价了外泌体来源的DEK对于治疗后肿瘤复发的作用。在放射治疗或药物治疗结束后给予富含DEK的外泌体处理,同样也发现富含野生型DEK的外泌体处理组,肿瘤体积明显增大,肺转移数量增多,休眠的CSCs增多(4周),生存期明显缩短。

小结:外泌体来源的DEK可以通过激活静息态的CSCs