2022.02.26 李博闻分享“胰腺癌干细胞通过外泌体通信网络促进肿瘤进展”的故事

今天给大家分享一篇今年发表在Gut上的一篇研究性论文《Extracellular Vesicles from Pancreatic Cancer Stem Cells Lead an Intratumor Communication Network (EVNet) to fuel tumor progression》。

文章的通讯作者是Sonia Melo，她来自葡萄牙，致力于研究肿瘤间信息交流，肿瘤异质性和外泌体。

我们知道，胰腺癌是癌中之王，五年生存率只有9%，在主要的肿瘤类型中排在最后一位。其中胰腺导管腺癌PDAC占胰腺癌总的发生病例的85%，这些患者中常常携带KRAS、CDKN2A、P53等基因突变，并且与肿瘤发生密切相关。目前胰腺癌的治疗手段十分有限，手术是唯一有治愈希望的手段。对于胰腺癌晚期病人，化疗放疗等可以延长肿瘤患者的生存时间，吉西他滨是FDA最先批准的化疗药物。研究胰腺癌发生发展机制对于胰腺癌诊疗具有重要意义。

胰腺癌预后较差的原因之一是肿瘤中含有低分化特征的干性细胞，这些干性细胞在不同的外界刺激下可以通过基因组、表观遗传改变行程异质性亚克隆群体。

之前有文献报道过乳腺癌亚群中通过wnt1这个分泌蛋白进行协作，促进肿瘤发展。那胰腺癌的亚克隆群落是否会有相互联系呢？

我们知道外泌体是细胞之间沟通的重要载体之一，所有细胞都可以分泌外泌体。有研究报道肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞能够通过外泌体相互作用，那肿瘤内部的亚克隆群是否也可以通过外泌体沟通呢？

于是，作者在这篇文章中就研究了这个问题，发现胰腺癌中的干细胞可以定向分泌外泌体给非干性细胞，并且其中含有的agrin可以介导YAP激活，导致肿瘤发生发展。作者找到的这个分泌蛋白不仅可以做靶点，也可以作为更好的临床诊断靶标，具有潜在的临床应用价值。

这是整篇文章的大纲。

要追踪不同细胞之间EV的交流，首先要对不同的亚群进行标记，而且要设置一个便于分辨的初始状态。因此，作者首先在胰腺癌细胞系分为四群，分别将4种高丰度外泌体marker接上不同荧光融合蛋白，就有了表现为4种不同荧光的细胞系，然后对应上胰腺癌细胞4种分型：利用胰腺癌4种干性marker，将胰腺癌细胞分为四种类型，CD24⁺44⁺、CD133⁺、CD24-CD44⁺、4N，在不同荧光的细胞系里面用分选纯化成特定的分型，就可以将胰腺癌细胞的分型与荧光一一对应，再将这些标记好荧光的细胞按照分型的比例重组，就组成了一个胰腺肿瘤发生交流的初始状态。

这是分选过程，并将筛选出来的干细胞和非干性细胞进行3D成球实验，验证了该分型方法的有效性。

接下来，作者将按比例重组的4种分型细胞混合培养72h，用荧光显微镜拍摄，统计各个细胞内是否有来自其他分型细胞的信号。发现出现外泌体介导的信号交换的细胞占70左右，说明肿瘤不同亚群的外泌体交流是普遍的现象。

分析EV来源时，发现来自干细胞的EV比来源于非干性细胞的要明显多一些，提示肿瘤亚克隆群体间的交流可能是由干细胞指向非干性细胞的。那到这里，这个实验其实还是有比较多的漏洞的，有没有哪位同学来提出一些质疑？

对的，如果要说明外泌体定向转移，必须要排除非特异性的数据差异。比如说会不会是干性细胞本身分泌外泌体多很多，或者说非干性细胞的摄取能力比干细胞强很多导致出现这种现象。

于是，作者首先采用了纳米颗粒跟踪分析技术，这种技术可以检测颗粒数量的微小变化。

那在A图里面就可以看到，把增加的外泌体平均到每个细胞来看，发现干细胞确实比非干性细胞要多一些，但是多的1.5倍是无法解释3%的干细胞却让97%的非干性细胞摄取更多的，说明外泌体分泌能力不是引起干性外泌体信号指向非干性细胞的原因。对于摄取能力的问题，作者设计加入了直径100nm的荧光小珠子，检测不同分型的摄取能力，发现干细胞摄取能力比非干性细胞还要好一些，并且非干性细胞降解EV的能力还要强于干性细胞。这两个实验就排除了非特异性的数据差异。证明了不同分型的胰腺癌亚克隆群之间，的确存在一种定向沟通的信息传递网。

为了检验信息网的作用，作者检测了缺氧条件下和吉西他滨处理下，这种信息网的变化情况。首先在缺氧处理下发现单个荧光信号的细胞减少，而有四种荧光的显著增加，说明由干细胞到非干性细胞的沟通强度加强，western blot实验检测外泌体marker表达情况，说明这一现象可能是缺氧诱导了外泌体产量的增加造成的。

不同的是，吉西他滨处理之后，不同信号数量细胞的比例没有明显改变，分析EV来源后作者发现非干性细胞之间的外泌体交流增加了。通过外泌体摄取实验发现，吉西他滨处理促进了外泌体的摄取，可能是导致外泌体交流变化的原因。

为了进一步明确这种定向的外泌体交流是否在这两种条件下对肿瘤生存有意义，作者针对外泌体释放的关键蛋白RAB27A进行基因编辑，通过四环素开关系统来研究外泌体分泌的生物学功能。其中Tet-on和Tet-off系统是经典的开关逻辑元件，tet-off就是加入四环素之后关闭的，tet-on就是加入tet会打开的通路。

这个图就是作者设计的shRAB27A的元件，作者对模型进行了验证，发现加入多西环素后，外泌体分泌减少，但是这种减少并没有改变其他分泌蛋白的成分。检测缺氧和吉西他滨处理的条件下细胞的活力，发现敲低Rab27a后胰腺癌面对这种环境，死亡率增加。证明外泌体的这种通讯网络可以帮助肿瘤应对生存环境的恶化

于是，作者构建了体内的模型。将上述的Tet开关的细胞原位接种到小鼠身上，一组用生理盐水，一组用多西环素处理，发现诱导敲除Rab27a的肿瘤生长和转移都得到了遏制。

为了更接近临床的情况，作者还构建了KRAS、P53突变胰腺癌自发肿瘤模型以及PDX模型，处理Rab27a抑制剂，发现对于生存期和肿瘤大小均有显著抑制效果。

为了验证这个问题，作者将诱导敲除Rab27a的干细胞与没有敲除的非干性细胞按比例重组，原位接种到小鼠体内，发现仍然能抑制肿瘤的发生发展并延长小鼠的生存时间。

除此之外，作者还用了基因鼠进行了验证。除了构建KRAS、p53突变的原发肿瘤模型外，还引入了他莫昔芬诱导翻转酶的编辑系统。

于是对于构建好的原发小鼠诱导肿瘤后，再利用他莫昔芬诱导Rab27a敲除，分选出敲除的干细胞，与野生型的非干性细胞按比例重组，原位接种到受体小鼠体内，发现也对小鼠的生存期有影响。

在PDX小鼠模型中，消化分选出干细胞，用Rab27a抑制剂处理或不处理，然后与非干细胞重组，进行原位接种，发现结论也是一致的。说明干性细胞分泌的外泌体对于胰腺癌发生发展具有重要的促进作用。

于是作者分选了4种胰腺癌细胞，按照干性Marker分了5种分型，分别测外泌体和细胞裂解液中的蛋白，发现EV中的蛋白与细胞中的确实有较大差异，说明干性细胞外泌体在分泌过程中经过了特定的分选和富集过程。

最终从差异蛋白中富集到了Axon guidance（轴突引导）通路，并且这一通路在干性细胞和非干性细胞中富集指数截然相反，符合我们的预期。我们对于不同分型进行一一富集，发现丰度很高的关键分子里面就有Axon通路中的Agrin蛋白（聚集蛋白），这个蛋白被多篇文章报道在肿瘤发生发展中扮演重要角色。

并且有文章报道Agrin可以感应细胞间基质的变化，并激活YAP，与肿瘤增殖密切相关。提示Agrin可能通过诱导YAP激活促进胰腺癌的发生发展。

作者在诱导敲除Rab27a的细胞系中发现YAP核定位信号减弱，在不敲除Agrin的细胞系里面信号增强。

并且在体内模型里面也验证了YAP入核的变化。同时还验证了已经被报道过的Agrin-LRP4-YAP信号轴在胰腺癌发生发展的作用。

作者接下来在体内模型中验证上述分子机制，诱导敲除干细胞的Agrin之后，显著抑制了YAP的激活和肿瘤的生长。

PDX模型里面也是显著抑制了胰腺癌的生长和YAP表达，提示了agrin的临床治疗潜在价值。

然后对于临床诊断，作者检测患者血液里面Agrin阳性外泌体并且与临床的多个指标进行比对，符合诊断指标的要求。

同时，应用ROC来评估诊断指标的可行性，这个图纵坐标代表真阳性，横坐标代表假阳性，所以曲线越偏向左上角说明指标越可靠。

我们看到agrin作为诊断指标要显著优于之前文献报道的CA19-9，并且联合干性marker CD133进行诊断后，其诊断结果更加可靠，为临床上胰腺癌的诊断提供了更好的选择。

总之，作者通过前沿技术证明了胰腺癌亚克隆细胞之间存在外泌体介导的信息交流，并找到了外泌体中发挥作用的重要蛋白agrin及其下游信号通路，明确了胰腺癌发生发展过程中的重要分子机理。并且与临床紧密结合，提出了更优的早期临床诊断标记物，对胰腺癌的临床诊疗具有重要意义。